重組尿酸酶基因工程菌的構(gòu)建與表達(dá)及應(yīng)用模型的篩選

發(fā)布時(shí)間：2020-03-21 01:09

【摘要】：高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)是以尿酸(uric acid,UA)升高為主要特征的一組疾病,不僅引起痛風(fēng),而且有研究表明HUA可能是胰島素抵抗、血脂異常、高血壓、脂肪肝、慢性腎病等多種代謝相關(guān)性疾病和心血管疾病發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;且血清尿酸(serum uric acid,SUA)升高伴發(fā)的相關(guān)危害程度的廣泛性,已經(jīng)成為威脅全人類(lèi)生活質(zhì)量的一大健康隱患,對(duì)于HUA的防治和基礎(chǔ)研究已成為熱點(diǎn)之一。目前研究顯示,致HUA的主要原因是,UA排泄減少;UA是人體內(nèi)嘌呤代謝的終產(chǎn)物,在正常狀態(tài)下,體內(nèi)2/3的UA經(jīng)腎臟排泄,約1/3的UA經(jīng)腸道排泄。但是由于UA自身有限的水溶性,使其在通過(guò)腎臟的排泄時(shí)易引起泌尿系尿酸性結(jié)石;且目前臨床上,治療HUA和痛風(fēng)的藥物副作用極大;增加腸道的尿酸排泄量,為人類(lèi)降低SUA提供了新的思路。尿酸酶能催化UA分解為CO_2、H_2O_2和尿囊素,而人類(lèi)尿酸酶基因在進(jìn)化過(guò)程中存在無(wú)義突變,機(jī)體缺乏該酶,使人體內(nèi)UA不能進(jìn)一步氧化分解,在某些病理情況下,由于嘌呤代謝紊亂,血液中UA積累過(guò)多,會(huì)導(dǎo)致HUA,繼而引發(fā)痛風(fēng)。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建攜帶尿酸酶基因的工程菌株,并在尿酸酶N端引入信號(hào)肽使其在細(xì)胞外進(jìn)行表達(dá),加速腸道UA的分解,發(fā)揮降UA作用;同時(shí)建立不同類(lèi)型的HUA大鼠模型,為后續(xù)工程菌株的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1.構(gòu)建重組尿酸酶表達(dá)菌株。以本實(shí)驗(yàn)保存載體(攜帶尿酸酶基因)為模板,PCR擴(kuò)增suox(SPA信號(hào)肽+尿酸酶編碼基因),并將其克隆至pMG36e(大腸桿菌-乳酸菌的穿梭載體)中,即pMG36e-suox。同時(shí)合成spo(乳酸菌信號(hào)肽)將其與uox(尿酸酶基因)連接后克隆至pMG36e中,即pMG36e-spo-uox。測(cè)序鑒定兩種載體。測(cè)序結(jié)果與GenBank查詢(xún)結(jié)果一致。2.重組尿酸酶的表達(dá)。將測(cè)序正確的含pMG36e-spo-uox、pMG36e-suox的BL菌株,擴(kuò)大培養(yǎng)后,分別檢測(cè)兩表達(dá)載體于不同時(shí)間點(diǎn)在周質(zhì)空間、上清液及包涵體蛋白表達(dá)量。結(jié)果pMG36e-spo-uox、pMG36e-suox成功在細(xì)胞外表達(dá),且在9h獲得最大表達(dá)量。3.單純果糖喂養(yǎng)和氧嗪酸鉀聯(lián)合果糖建立高尿酸血癥大鼠模型的比較研究。利用隨機(jī)數(shù)字表法,將60只雄性SD大鼠平均分為6組,即5%Fru組(單用5%濃度的果糖喂養(yǎng))、5%FPO組(用5%果糖+氧嗪酸鉀處理)、10%Fru(單用10%果糖喂養(yǎng))、10%FPO組(10%果糖水+氧嗪酸鉀處理)、PO組(單用氧嗪酸鉀處理)、Con組(空白對(duì)照組,單用清水飼喂);實(shí)驗(yàn)建模14w;每周檢測(cè)大鼠SUA、血清尿素氮(serum urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(serum Creatinine,SCr)水平,并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采集大鼠肝腎組織,觀察其組織學(xué)變化情況。結(jié)果在較短時(shí)間內(nèi),5%Fru組、10%FPO組、10%FPO組均能迅速升高SUA(P0.01);10%Fru組SUA水平不穩(wěn)定,在第10w、11w SUA水平明顯下降,顯著低于5%FPO組、10%FPO組(P0.01)。在第6w,10%果糖處理組BUN水平開(kāi)始升高(P0.01),在第7w SCr水平開(kāi)始升高(P0.01)。10%果糖處理組可見(jiàn)腎臟組織學(xué)改變,5%FPO組偶見(jiàn)輕微腎臟組織學(xué)改變,其余各組未見(jiàn)腎臟組織學(xué)改變;未見(jiàn)各組大鼠肝臟有明顯組織學(xué)變化。果糖聯(lián)合氧嗪酸鉀能夠快速建立穩(wěn)定的HUA大鼠模型,不同濃度果糖對(duì)腎臟改變狀態(tài)不同,根據(jù)后續(xù)研究需要選擇相應(yīng)的模型。
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