【摘要】：隨著抗生素的大量使用,抗生素耐藥性問題已成為一個日益嚴(yán)重的人類健康威脅,因而控制耐藥菌的產(chǎn)生和傳播至關(guān)重要。由于在畜禽類動物的養(yǎng)殖過程中常常添加抗生素,使得動物糞便成為抗生素耐藥性的重要源頭�？股啬退幓�(ARGs)是一種新型的環(huán)境污染物,可通過水平基因轉(zhuǎn)移在不同的細(xì)菌之間傳播耐藥性。動物糞便中攜帶的大量ARGs進(jìn)入環(huán)境之后,可能通過耐藥性的傳播最終加速耐藥致病菌的產(chǎn)生。厭氧發(fā)酵是常用的糞便處理方法,且對ARGs具有一定的去除效果。本課題的目的是探究厭氧發(fā)酵過程中影響ARGs去除率的因素和機制,為徹底減少厭氧發(fā)酵過程中的ARGs輸出提供理論依據(jù)。溫度作為影響厭氧發(fā)酵的主要因素之一,會對ARGs的去除率產(chǎn)生影響。本課題采用豬糞便為發(fā)酵底物,在不同的糞便化學(xué)需氧量(COD)濃度(0.4,1.2,2,5 g/L)下分別進(jìn)行低溫(22℃)、中溫(37℃)和高溫(55℃)厭氧發(fā)酵,使用宏基因組測序方法研究了厭氧發(fā)酵過程中ARGs、微生物和質(zhì)粒的動態(tài)變化趨勢,并比較不同發(fā)酵條件對ARGs去除率的影響,以及ARGs與潛在宿主菌、質(zhì)粒之間的相關(guān)性。此外,本課題還依據(jù)文獻(xiàn)選取在豬糞便中普遍存在的4個ARGs,使用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)進(jìn)行檢測,比較了宏基因組測序和qPCR方法在ARGs檢測中的優(yōu)缺點。得出的主要結(jié)果和結(jié)論如下:在豬糞便中,含量最豐富的ARGs為四環(huán)素類ARGs,占所有檢測到的ARGs含量的58%,其次是氨基糖苷類(15%),MLS類(大環(huán)內(nèi)酯—林可酰胺—鏈陽菌素B)(15%)和磺胺類(10%),此4類ARGs合計占總ARGs的98%。這與養(yǎng)豬業(yè)中常用的抗生素種類相符。對于單個ARGs而言,tet36的含量最高(13.6%),依次遞減為tetW(10.0%),tetQ(9.1%),sul2(8.7%)和tetX(6.0%)等。對于ARGs的去除,高溫顯示出較好的整體效果。但在不同COD濃度的厭氧發(fā)酵過程中,溫度對ARGs去除率的影響不完全一致;因此,COD對ARGs的去除有所影響。低濃度下(0.4和1.2 g/L),高溫更有助于ARGs的去除。而在COD濃度為2 g/L時,37°C的去除率高于55°C。濃度為5g/L時,37℃與55°C的去除率相同。在55℃發(fā)酵中,當(dāng)COD濃度為2 g/L時,一些基因在第12天降至最低,第16天時卻有回升,包括tetW、sul2、tet44、tetL等。表明發(fā)酵時間的長短也會影響ARGs的去除。發(fā)酵過程中大部分ARGs的含量隨著時間的推移而降低,且發(fā)酵第4天發(fā)生明顯的下降。同樣,微生物豐度在第4天發(fā)生劇烈變化,表明微生物菌群的變化是影響ARGs含量的重要原因。通過分析ARGs和微生物菌群之間的相關(guān)性,表明主要的宿主菌是Bacteroides propionicifaciens,Pseudomonas caeni,Lactobacillus spp.和Bifidobacterium pseudolongum。在所有的ARGs中,分布最廣的為tetW和tet36。本課題還首次分析了厭氧發(fā)酵過程中,質(zhì)粒與ARGs變化的關(guān)系,表明了質(zhì)粒在ARGs去除中的重要作用�？傮w而言,來自變形菌門的質(zhì)粒更容易攜帶ARGs,因此變形菌是豬糞便中要著重去除的細(xì)菌。在4種ARGs的檢測中,分別用qPCR和宏基因組檢測二種方法測得的基因豐度不一致。但這兩種方法所測得的基因的變化趨勢較為一致。上述結(jié)果表明qPCR在檢測過程中,可能會由于引物擴(kuò)增偏差而導(dǎo)致不能很好地比較不同基因之間的豐度,但可用于比較同一基因相對變化情況。綜上所述,豬糞便中含有豐富的ARGs,高溫厭氧發(fā)酵能較好的去除豬糞便中的ARGs。溫度、COD和發(fā)酵時間都是影響ARGs去除的重要因素。這些影響因素是通過影響微生物菌群及其攜帶質(zhì)粒的變化起作用的。本課題的研究結(jié)果可為豬糞便厭氧發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化提供參考,也讓我們對豬糞便厭氧發(fā)酵中去除ARGs的機制有了更深入的了解,并對研究其他類型的厭氧發(fā)酵有啟示作用。
【圖文】：

圖 1.1 重要耐藥事件發(fā)生的時間表[2]Figure 1.1 Timeline of key antibiotic resistance events日期基于最早的文獻(xiàn)報道。對于多重耐藥不動桿菌和假單胞菌，其日事件暴發(fā)的報道。2.青霉素于 1928 年發(fā)現(xiàn)，但在 1943 年廣泛使用之素的使用受到限制。耐藥性的生物學(xué)機制

圖 1.2 抗生素耐藥性的水平傳播途徑[21]。 Abr=抗生素耐藥性Figure 1.2 Mechanism of horizontal transfer of antibiotic resistance等（2016）分析了超過 23 000 個細(xì)菌基因組中 ARGs 的存在特征[22] ARGs 主要存在于四個細(xì)菌門：變形菌門(Proteobacteria)，厚壁tes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，并且在變形集[22]。所有含超過 40 種移動性 ARGs 的細(xì)菌全部來自變形菌門。另中的 ARGs 轉(zhuǎn)移是最活躍的。其原因可能是許多人類病原菌來自于而可能經(jīng)歷更多的抗生素選擇壓力。研究進(jìn)一步證實了近 70％的已Gs 與移動原件基因共存，這表明移動元件在促進(jìn) ARGs 的轉(zhuǎn)移中發(fā)種水平上進(jìn)行分析，四環(huán)素耐藥基因 tetM 和 tetQ 以及磺胺耐藥基因廣泛的轉(zhuǎn)移性 ARGs，，而在屬水平上則是 tetC、tetW 和 sul1。究 ARGs 的分子生物學(xué)方法PCR 和實時定量 PCR 技術(shù)
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X713

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本文編號：2591587