【摘要】：蛋白質(zhì)的泛素化是一種可逆的翻譯后修飾,參與了細胞內(nèi)一系列生理反應(yīng),包括蛋白質(zhì)降解、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、表觀遺傳修飾、細胞定位等,并且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。去泛素化酶(DUBs)是泛素化修飾的負向調(diào)節(jié)因子,理解去泛素化酶的功能和作用機制是目前的研究熱點。目前已知的去泛素化酶主要包括UBP/USP家族、UCH家族、OTU家族、JAMM家族、MJD家族和MCPIP家族。其中,OTU家族作為去泛素化酶中的第二大家族,在DNA損傷修復(fù)、炎癥免疫應(yīng)答、代謝穩(wěn)態(tài)維持、腫瘤發(fā)生發(fā)展等多個方面發(fā)揮著重要的功能。目前人源OTU家族共發(fā)現(xiàn)16個具有去泛素化酶催化活性的成員,主要可分為Otubains、A20-like OTUs和OTUDs三個亞家族,該家族成員主要通過高度保守的OTU結(jié)構(gòu)域行使其去泛素化酶的催化活性,且該家族成員對底物的去泛素化修飾具有鏈型特異性。OTUD4是OTUDs亞家族中的一個成員,目前已報道的去泛素化酶OTUD4修飾的底物泛素鏈類型有K48型泛素鏈和K63型泛素鏈。其中,OTUD4可通過自身第202位和204位絲氨酸的磷酸化來激活其去泛素化酶活性,從而去除TLR信號通路關(guān)鍵接頭蛋白MyD88的K63型泛素鏈,進而實現(xiàn)對先天免疫的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。此外,OTUD4還可以酶活非依賴的方式調(diào)節(jié)DNA去甲基化酶ALKBH2和ALKBH3的蛋白穩(wěn)定性,進而促進DNA的烷基化損傷修復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn)伴隨有共濟失調(diào)和低促性腺素癥患者體內(nèi)Otud4基因存在非酶活突變,Otud4基因突變是否是導(dǎo)致這一綜合癥的主要原因及其調(diào)控這一綜合癥的功能機制是什么仍然未知。為了深入探究OTUD4的生理功能,我們通過Cre-Loxp策略構(gòu)建了去泛素化酶OTUD4基因敲除小鼠模型,并對該小鼠模型進行了初步的表型分析。我們目前的研究結(jié)論主要有:1.Otud4基因敲除后,Otud4~(-/-)小鼠能夠正常出生和存活,并且其出生率符合孟德爾遺傳規(guī)律;此外,與同窩Otud4~(+/+)小鼠相比,Otud4~(-/-)小鼠在體型、體重等方面均沒有顯著性差異;2.通過解剖發(fā)現(xiàn),與同窩Otud4~(+/+)小鼠相比,Otud4~(-/-)小鼠的大腦、小腦、胸腺、肺、心臟、肝臟、腎臟、脾臟在重量上均沒有統(tǒng)計學(xué)差異;3.小鼠組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn),Otud4~(-/-)小鼠的大腦、小腦、肺、心臟、肝臟、腎臟、脾臟并無明顯的病理學(xué)異常;4.對同窩Otud4~(+/+)小鼠和Otud4~(-/-)小鼠進行血象分析和血糖監(jiān)測發(fā)現(xiàn),Otud4~(-/-)小鼠的血象和血糖也均正常。OTUD4究竟具有哪些生理功能,我們?nèi)匀贿�需探索。綜上所述,我們采用Cre-Loxp策略首次構(gòu)建了去泛素化酶OTUD4的基因敲除小鼠模型并對其表型進行了初步分析。我們的研究發(fā)現(xiàn),Otud4基因敲除后,Otud4~(-/-)小鼠能夠正常出生和存活,并且主要組織器官并沒有明顯病理學(xué)異常,小鼠血液中的成分和血糖濃度也均正常。Otud4基因敲除小鼠模型的成功構(gòu)建為進一步探究去泛素化酶OTUD4的生理功能奠定了基礎(chǔ)。巨噬細胞是機體內(nèi)重要的免疫細胞,其分布于全身的各個組織中,在機體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的功能。巨噬細胞具有較強的異質(zhì)性和可塑性,即巨噬細胞在不同的組織中具有不同的形態(tài)和功能,在不同的刺激條件下,巨噬細胞的表型也存在差異。通常,人們將巨噬細胞按功能劃分為經(jīng)典激活的巨噬細胞(M1型巨噬細胞)和非經(jīng)典激活的巨噬細胞(M2型巨噬細胞)。在炎癥反應(yīng)過程中,M1型巨噬細胞通常被促炎細胞因子IFN-γ或其他微生物產(chǎn)物(如LPS)激活,從而呈現(xiàn)促炎表型,而M2型巨噬細胞通常被抑炎細胞因子如IL-4、IL-13、IL-10以及TGF-β激活,從而呈現(xiàn)抑炎表型。M1型和M2型是巨噬細胞極化的兩個極端。巨噬細胞極化的激活和失活在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的功能,目前有關(guān)調(diào)控巨噬細胞極化的分子機制研究還很有限,因此,鑒定更多調(diào)控巨噬細胞極化的分子對于更好了解巨噬細胞功能的發(fā)揮具有重要意義。CKIP-1是一個含PH結(jié)構(gòu)域、與細胞骨架相關(guān)的蛋白,其參與調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡等眾多生物學(xué)過程。我們的研究發(fā)現(xiàn)CKIP-1是調(diào)控巨噬細胞極化的一個分子開關(guān),其受M1和M2極化經(jīng)典刺激信號的調(diào)節(jié),并且反過來可以通過負反饋回路同時調(diào)節(jié)M1和M2型巨噬細胞極化。首先,我們通過篩選發(fā)現(xiàn)CKIP-1在小鼠骨髓來源的巨噬細胞BMDM和腹腔巨噬細胞PM中均高表達;其次,我們發(fā)現(xiàn)在促炎M1刺激物(如LPS和IFN-γ)誘導(dǎo)下,CKIP-1在人源和鼠源BMDM中表達增加,而在抑炎M2刺激物(如IL-4和IL-13)誘導(dǎo)下,CKIP-1在人源和鼠源BMDM中表達下調(diào)。此外,在生理上,我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞特異性CKIP-1缺失對抑制體內(nèi)TPA誘導(dǎo)的皮膚炎癥是不可或缺的。以上研究表明,CKIP-1是一種新的調(diào)控巨噬細胞極化的關(guān)鍵分子。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q75

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本文編號：2590398