【摘要】：褐飛虱(Nilaparvat lugens)是我國水稻上的重要害蟲,食性單一,只能在水稻上取食和繁殖,成蟲具有明顯的翅二型現(xiàn)象,短翅型適宜于定居繁殖,長翅型具有遠(yuǎn)距離遷飛習(xí)性。本文通過Dnmt基因的dsRNA注射干擾、miRNA靶標(biāo)預(yù)測及雙熒光素酶報告基因體外驗證等實驗,發(fā)現(xiàn)DNA甲基化對褐飛虱翅型分化具有調(diào)控作用。1.干擾Dnmt基因?qū)诛w虱翅型分化的影響解剖了普通種群褐飛虱成蟲的頭、胸、中腸、脂肪體、卵巢和精巢6個組織,采用實時熒光定量PCR方法檢測了褐飛虱不同組織DNA methyltransferase 1(Dnmt1)和DNAmethyltransferase3(Dnmt3)基因的表達水平。結(jié)果表明,Dnmtl和Dnmt3基因均在卵巢的表達量最高,卵巢與精巢中的表達量有顯著差異。選取了剛羽化2天的短翅種群褐飛虱雌成蟲進行注射干擾,注射完成后將褐飛虱放入帶有水稻苗的燒杯中繼續(xù)飼養(yǎng),并放入50頭剛羽化2天左右的短翅種群雄蟲讓其交配。統(tǒng)計后代成蟲的長短翅型比例,發(fā)現(xiàn)注射dsDnmt3后短翅種群后代的長翅褐飛虱比例顯著增加,注射dsDnmtl后無明顯差異,表明Dnmt3參與的DNA從頭甲基化參與調(diào)控褐飛虱的翅型分化。2.靶向Dnmt基因的miRNA預(yù)測利用miRanda、TargetScan、microTar、PITA、RNAhybrid五個miRNA靶標(biāo)預(yù)測軟件對可能靶向Dnmt基因的miRNA分別進行預(yù)測,然后利用在線網(wǎng)站對五個軟件的預(yù)測結(jié)果取交集來縮小靶向靶基因的miRNA選擇范圍,減小誤差。結(jié)果表明,對Dnmtl基因,五個軟件都預(yù)測到靶向的miRNA有1個,四個軟件都預(yù)測到靶向的miRNA有2個,三個軟件都預(yù)測到靶向的miRNA有5個。沒有miRNA被五個軟件都預(yù)測到靶向Dnmt3基因,四個軟件都預(yù)測到靶向Dnmt3基因的miRNA有1個,三個軟件都預(yù)測到靶向Dnmt3基因的miRNA有2個。3.靶向Dnmt基因的miRNA表達分析選取了部分靶向Dnmt1和Dnmt3基因的miRNA(miR-124、miR-263a、miR-263b、miR-980)進行表達分析,檢測了這些miRNA在褐飛虱長短翅兩個種群1齡至5齡若蟲階段的表達水平。結(jié)果表明,其在若蟲階段存在不同程度的表達差異。miR-124基因在長翅型種群若蟲1齡、5齡、羽化后第四天雄成蟲的表達水平均明顯高于短翅型種群;miR-263b在若蟲1齡、2齡、5齡、羽化后第四天的雄成蟲階段的表達水平也存在顯著差異;miR-980僅在若蟲1到4齡階段中長翅種群表達水平明顯高于短翅型種群。4.miRNA靶向Dnmt的雙熒光素酶驗證構(gòu)建了Dnmt 和Dnmt3基因的雙熒光素酶報告基因載體,對部分軟件預(yù)測結(jié)果進行了實驗驗證。結(jié)果顯示,與對照相比,褐飛虱中miR-263a、miR-263b、miR-279-5p對帶有靶標(biāo)基因Dnmt1 3'UTR的luciferase表達具有極顯著的抑制,表明miR-263a、miR-263b、miR-279-5p在體內(nèi)可能對Dnmtl具有極顯著的負(fù)調(diào)控作用。褐飛虱中miR-2a、miR-87a對帶有靶標(biāo)基因Dnmt3 3'UTR的luciferase表達具有顯著的抑制,表明miR-2a、miR-87a在體內(nèi)可能對Dnmt3具有顯著的負(fù)調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.112.3

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