【摘要】：為研究棉花CBF2基因在植物抗逆中的作用,構建了p CAMBIA1300-At CBF2P-Gb CBF2-At CBF2T植物互補表達載體,并對擬南芥cbf2突變體進行遺傳轉化。以新海16 c DNA為材料,采用PCR的方法克隆4個棉花CBF2基因,同時克隆擬南芥CBF2基因啟動子At CBF2P和終止子At CBF2T,并將這些基因與p Bluescript SK載體連接,構建p Bluescript SK-At CBF2P-Gb CBF2-At CBF2T中間過渡載體,用SacⅠ和Bam HⅠ雙酶切中間載體,獲得At CBF2P-Gb CBF2-At CBF2T核心片段,將此片段插入到p CAMBIA1300表達載體中,構建p CAMBIA1300-At CBF2P-Gb CBF2-At CBF2T植物互補表達載體。以擬南芥cbf2突變體為材料,采用農桿菌介導的方法進行遺傳轉化,獲得轉棉花CBF2基因群體。獲得轉基因株系后,將為篩選出棉花的CBF2抗凍負調控基因及棉花抗逆分子育種奠定基礎。
【圖文】：

44華北農學報31卷A．菌落PCＲ分析;B．載體的酶切鑒定;M．Trans1KDNAMarker;1、3、4、6、10、11為陽性克攏A．ColonyPCＲ;B．Enzymedigestionofvector;M．Trans1KDNAMarker;1，3，4，6，10，11areforpositiveclones．圖3pBluescriptSK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T載體的構建與鑒定Fig．3ConstructionandidentificationofpBluescriptSK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2TvectorM．Trans1KDNAMarker;1，4，6，8，10為正確的pCAMBIA1300-GbCBF2。M．Trans1KDNAMarker;1，4，6，8，10arefortherightpCAMBIA1300-GbCBF2clone．圖4pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T互補表達載體酶切分析Fig．4AnlysisofenzymedigestionofcomplementaryexpressionvectorpCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T圖5轉基因植株抗性篩選Fig．5Theresistancescreeningoftransgenicplant3討論CBF/DＲEB轉錄因子能特異性與脅迫誘導基因啟動子區(qū)域的CＲT/DＲE(C-repeat/dehydration-re-sponsiveelement)順式作用元件結合，激活抗逆功能基因的表達，最終通過基因產物的作用增強植物的抗逆性［13－14］。擬南芥CBF1/DＲEB1C、CBF2/DＲEB1B、CBF3/DＲEB1A，在植物抗凍反應中扮演中心的調控角色;超表達CBF1和CBF3都能顯著提高植物的抗凍性［15－16］。而CBF2基因雖然與CBF1和CBF3基因高度同源，但在植物抗逆中卻扮演重要的負調控角色。該基因負調控CBF1和CBF3的表達，其突變失活后，CBF1和CBF3基因的表達都同時顯著提高，因此擬南芥的抗凍性顯著增強［17－18］。與CBF1和CBF3過量表達植株不同的是，在cbf2突變體中CBF1和CBF3基因的表達并不是持續(xù)地提高，其表達受到了嚴格調控，在冷脅迫后期兩者的表達量又逐漸下降，從而使CBF1和CBF3基因過量表達在生長發(fā)育上所產?

Trans1KDNAMarker;1，3，4，6，10，11areforpositiveclones．圖3pBluescriptSK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T載體的構建與鑒定Fig．3ConstructionandidentificationofpBluescriptSK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2TvectorM．Trans1KDNAMarker;1，4，6，8，10為正確的pCAMBIA1300-GbCBF2。M．Trans1KDNAMarker;1，4，6，8，10arefortherightpCAMBIA1300-GbCBF2clone．圖4pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T互補表達載體酶切分析Fig．4AnlysisofenzymedigestionofcomplementaryexpressionvectorpCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T圖5轉基因植株抗性篩選Fig．5Theresistancescreeningoftransgenicplant3討論CBF/DＲEB轉錄因子能特異性與脅迫誘導基因啟動子區(qū)域的CＲT/DＲE(C-repeat/dehydration-re-sponsiveelement)順式作用元件結合，激活抗逆功能基因的表達，最終通過基因產物的作用增強植物的抗逆性［13－14］。擬南芥CBF1/DＲEB1C、CBF2/DＲEB1B、CBF3/DＲEB1A，在植物抗凍反應中扮演中心的調控角色;超表達CBF1和CBF3都能顯著提高植物的抗凍性［15－16］。而CBF2基因雖然與CBF1和CBF3基因高度同源，但在植物抗逆中卻扮演重要的負調控角色。該基因負調控CBF1和CBF3的表達，其突變失活后，CBF1和CBF3基因的表達都同時顯著提高，因此擬南芥的抗凍性顯著增強［17－18］。與CBF1和CBF3過量表達植株不同的是，在cbf2突變體中CBF1和CBF3基因的表達并不是持續(xù)地提高，其表達受到了嚴格調控，在冷脅迫后期兩者的表達量又逐漸下降，從而使CBF1和CBF3基因過量表達在生長發(fā)育上所產生的負效應得到了很好的控制。因此，，cbf2突變體最突出的表現(xiàn)是，雖然植株的抗凍性明顯增加，但cbf2突變體在生長發(fā)育上與野生型相比并沒有明顯差異［1

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