【摘要】：為研究棉花CBF2基因在植物抗逆中的作用,構(gòu)建了p CAMBIA1300-At CBF2P-Gb CBF2-At CBF2T植物互補(bǔ)表達(dá)載體,并對(duì)擬南芥cbf2突變體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。以新海16 c DNA為材料,采用PCR的方法克隆4個(gè)棉花CBF2基因,同時(shí)克隆擬南芥CBF2基因啟動(dòng)子At CBF2P和終止子At CBF2T,并將這些基因與p Bluescript SK載體連接,構(gòu)建p Bluescript SK-At CBF2P-Gb CBF2-At CBF2T中間過(guò)渡載體,用SacⅠ和Bam HⅠ雙酶切中間載體,獲得At CBF2P-Gb CBF2-At CBF2T核心片段,將此片段插入到p CAMBIA1300表達(dá)載體中,構(gòu)建p CAMBIA1300-At CBF2P-Gb CBF2-At CBF2T植物互補(bǔ)表達(dá)載體。以擬南芥cbf2突變體為材料,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得轉(zhuǎn)棉花CBF2基因群體。獲得轉(zhuǎn)基因株系后,將為篩選出棉花的CBF2抗凍負(fù)調(diào)控基因及棉花抗逆分子育種奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

44華北農(nóng)學(xué)報(bào)31卷A．菌落PCＲ分析;B．載體的酶切鑒定;M．Trans1KDNAMarker;1、3、4、6、10、11為陽(yáng)性克攏A．ColonyPCＲ;B．Enzymedigestionofvector;M．Trans1KDNAMarker;1，3，4，6，10，11areforpositiveclones．圖3pBluescriptSK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T載體的構(gòu)建與鑒定Fig．3ConstructionandidentificationofpBluescriptSK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2TvectorM．Trans1KDNAMarker;1，4，6，8，10為正確的pCAMBIA1300-GbCBF2。M．Trans1KDNAMarker;1，4，6，8，10arefortherightpCAMBIA1300-GbCBF2clone．圖4pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T互補(bǔ)表達(dá)載體酶切分析Fig．4AnlysisofenzymedigestionofcomplementaryexpressionvectorpCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T圖5轉(zhuǎn)基因植株抗性篩選Fig．5Theresistancescreeningoftransgenicplant3討論CBF/DＲEB轉(zhuǎn)錄因子能特異性與脅迫誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的CＲT/DＲE(C-repeat/dehydration-re-sponsiveelement)順式作用元件結(jié)合，激活抗逆功能基因的表達(dá)，最終通過(guò)基因產(chǎn)物的作用增強(qiáng)植物的抗逆性［13－14］。擬南芥CBF1/DＲEB1C、CBF2/DＲEB1B、CBF3/DＲEB1A，在植物抗凍反應(yīng)中扮演中心的調(diào)控角色;超表達(dá)CBF1和CBF3都能顯著提高植物的抗凍性［15－16］。而CBF2基因雖然與CBF1和CBF3基因高度同源，但在植物抗逆中卻扮演重要的負(fù)調(diào)控角色。該基因負(fù)調(diào)控CBF1和CBF3的表達(dá)，其突變失活后，CBF1和CBF3基因的表達(dá)都同時(shí)顯著提高，因此擬南芥的抗凍性顯著增強(qiáng)［17－18］。與CBF1和CBF3過(guò)量表達(dá)植株不同的是，在cbf2突變體中CBF1和CBF3基因的表達(dá)并不是持續(xù)地提高，其表達(dá)受到了嚴(yán)格調(diào)控，在冷脅迫后期兩者的表達(dá)量又逐漸下降，從而使CBF1和CBF3基因過(guò)量表達(dá)在生長(zhǎng)發(fā)育上所產(chǎn)?

Trans1KDNAMarker;1，3，4，6，10，11areforpositiveclones．圖3pBluescriptSK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T載體的構(gòu)建與鑒定Fig．3ConstructionandidentificationofpBluescriptSK-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2TvectorM．Trans1KDNAMarker;1，4，6，8，10為正確的pCAMBIA1300-GbCBF2。M．Trans1KDNAMarker;1，4，6，8，10arefortherightpCAMBIA1300-GbCBF2clone．圖4pCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T互補(bǔ)表達(dá)載體酶切分析Fig．4AnlysisofenzymedigestionofcomplementaryexpressionvectorpCAMBIA1300-AtCBF2P-GbCBF2-AtCBF2T圖5轉(zhuǎn)基因植株抗性篩選Fig．5Theresistancescreeningoftransgenicplant3討論CBF/DＲEB轉(zhuǎn)錄因子能特異性與脅迫誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的CＲT/DＲE(C-repeat/dehydration-re-sponsiveelement)順式作用元件結(jié)合，激活抗逆功能基因的表達(dá)，最終通過(guò)基因產(chǎn)物的作用增強(qiáng)植物的抗逆性［13－14］。擬南芥CBF1/DＲEB1C、CBF2/DＲEB1B、CBF3/DＲEB1A，在植物抗凍反應(yīng)中扮演中心的調(diào)控角色;超表達(dá)CBF1和CBF3都能顯著提高植物的抗凍性［15－16］。而CBF2基因雖然與CBF1和CBF3基因高度同源，但在植物抗逆中卻扮演重要的負(fù)調(diào)控角色。該基因負(fù)調(diào)控CBF1和CBF3的表達(dá)，其突變失活后，CBF1和CBF3基因的表達(dá)都同時(shí)顯著提高，因此擬南芥的抗凍性顯著增強(qiáng)［17－18］。與CBF1和CBF3過(guò)量表達(dá)植株不同的是，在cbf2突變體中CBF1和CBF3基因的表達(dá)并不是持續(xù)地提高，其表達(dá)受到了嚴(yán)格調(diào)控，在冷脅迫后期兩者的表達(dá)量又逐漸下降，從而使CBF1和CBF3基因過(guò)量表達(dá)在生長(zhǎng)發(fā)育上所產(chǎn)生的負(fù)效應(yīng)得到了很好的控制。因此，，cbf2突變體最突出的表現(xiàn)是，雖然植株的抗凍性明顯增加，但cbf2突變體在生長(zhǎng)發(fā)育上與野生型相比并沒(méi)有明顯差異［1

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8 宋剛;油

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