【摘要】：干擾素(IFN)在天然的抗病毒免疫反應中具有重要的作用,而且干擾素還參與細胞的生長、分化以及免疫調節(jié),是一類重要的細胞因子。其中干擾素調節(jié)因子(IRFs)對IFN以及干擾素誘導基因(ISGs)的轉錄過程具有很關鍵的作用。IRFs是一種重要的轉錄因子,它可以調節(jié)免疫反應特別是針對抗病毒感染,包括誘導IFN的產生以及激活補體和自然殺傷性細胞,進而增強免疫反應,它還參與造血反應。IRFs一共有11個成員(IRF1-IRF11),其中在哺乳動物和禽類動物檢測出了10個成員,分別是IRF1、IRF2、IRF3、IRF4/PIP/LSIRF/ICSAT、IRF5、IRF6、IRF7、IRF8/ICSBP、IRF9/p48/ISGF3γ以及IRF10,IRF11目前只在魚類中檢測發(fā)現(xiàn)。這些成員在結構上共享保守區(qū)域:一個DNA結合區(qū)域(DBD);C末端一個IRF關聯(lián)域(IAD)(IRF1、IRF2除外)。它們在結構上共享保守區(qū)域,但功能上不盡相同;IRF4和IRF8通過免疫細胞增加端粒酶活性;IRF7是干擾素的主調節(jié)器;IRF9可以識別IRF3復合物(ISGF3)這段堿基序列,而ISGF3的識別是IFN應對病毒刺激的一個關鍵過程;IRF10與IRF1功能有些類似,可以調節(jié)鳥苷酸結合蛋白的表達;IRF5可以結合到IFN和ISGs的啟動子等作用。IRFs在進化分類上可以分為四個亞科:IRF1亞科(IRF1,IRF2,IRF11)、IRF3亞科(IRF3,IRF7)、IRF4亞科(IRF4,IRF8,IRF9,IRF10)、IRF5亞科(IRF5,IRF6)。在功能上分為三大類:活化劑(IRF1,IRF3,IRF9)、抑制劑(IRF8)、雙功能(IRF2,IRF4,IRF5,IRF7)。IRF1對于研究動物疾病是一個不錯的候選基因,也是一個具有多生物學功能的轉錄因子,參與抗病毒反應、細胞生長、細胞凋亡的調節(jié)。IRF2具有連同IRF家族成員形成復雜的IRF調控系統(tǒng),并且影響抗原遞呈、細胞周期以及抑制腫瘤等作用;但是IRF1、IRF2在鴨子上是否也具有相關功能目前還不清楚。鴨子在畜牧行業(yè)是一種很重要的物種,每年產肉(主要在亞洲)300萬噸,具有很高的經濟價值;但是每年鴨子因感染病毒造成巨大的經濟損失,所以我們有必要了解鴨子的某些抗病毒機制,提高鴨子的抗病毒效果。本實驗選取櫻桃谷肉鴨作為研究對象,研究內容主要包括三部分:第一部分櫻桃谷肉鴨IRF1、IRF2的克隆鑒定與進化分析。根據NCBI上公布的鴨IRF1、IRF2基因的保守區(qū)域設計引物,從正常櫻桃谷肉鴨的脾臟中提取總RNA,通過普通PCR方法擴增IRF1、IRF2的ORF序列。其中IRF1的ORF序列長954bp,編碼317個氨基酸;irf2的orf序列長1047bp,編碼348個氨基酸;利用軟件mega5.1對多個物種的irf1、irf2進行進化分析;結果顯示與櫻桃谷肉鴨同源性最高的是鴻雁(irf1、irf2可信度分別為93%、78%)。第二部分櫻桃谷肉鴨上irf1、irf2與其他物種的氨基酸對比分析以及生物學功能分析。利用在線軟件分析以及查閱相關文獻,我們對比了櫻桃谷肉鴨、雞、鼠、人的irf1和irf2序列,結果顯示這四個物種的氨基酸序列高度同源。參考其他文獻發(fā)irf1可以分為五個區(qū)域:n端抑制域、dna結合域、核定位域、轉錄結構域和增強子區(qū)域。irf2可以也可分為四個區(qū)域:dna結合域、轉錄結構域、干擾素關聯(lián)域和抑制域。第三部分櫻桃谷肉鴨irf1、irf2在健康鴨各個組織的分布情況以及感染病毒(坦布蘇病毒、新型呼腸弧病毒、鴨瘟病毒)之后irf1、irf2的消長規(guī)律。實時熒光定量pcr(qrt-pcr)分析結果顯示櫻桃谷肉鴨irf1和irf2基因在所有檢測器官中均表達,但不同組織表達量有差異,正常情況下檢測irf1表達的組織中當屬肺臟最高,irf2的表達心臟、肝臟、肺臟檢測的最高。為研究櫻桃谷肉鴨irf1和irf2是否參與抗病毒免疫應答,本實驗對櫻桃谷肉鴨肌肉注射鴨瘟病毒、新型呼腸弧病毒以及坦布蘇病毒。然后檢測irf1、irf2基因在病毒感染1、3、5天后脾臟和大腦中的表達水平變化。結果表明,櫻桃谷肉鴨irf1在感染病毒后1、3、5天后都迅速上調,其中鴨瘟病毒刺激后脾臟和大腦都是在1、3、5天上調倍數逐漸增加,都在第五天達到最大值(脾臟為7.33倍,大腦為7.95倍)。新型呼腸弧病毒刺激后,在1、3、5天都呈上調狀態(tài),在第一天達到峰值(脾臟為234.5倍,大腦為20.3倍)。坦布蘇病毒刺激后,脾臟上調不是很明顯,都在10倍以下;在大腦中上調非常明顯,1、3、5天都達到100倍以上,其中第一天達到最大值459.2倍。鴨瘟病毒刺激鴨子后,櫻桃谷肉鴨irf2在大腦和脾臟的表達都是上調的,其中第一天和第三天上調倍數比較平穩(wěn),脾臟約為35倍,大腦上調約為7倍;第五天達到最大值,脾臟上調151倍,大腦上調15倍。新型呼腸弧病毒刺激后,脾臟irf2第一天就達到最大上調倍數234.5倍,第三天和第五天也稱上調趨勢但是上調倍數逐漸減弱。大腦在第三天達到最大上調倍數8.6倍,不過這三天上調倍數較穩(wěn)定。坦布蘇病毒刺激鴨子后脾臟和大腦都是在第一天達到最大上調倍數,脾臟為52.3倍,大腦為371倍,其上調規(guī)律與新型呼腸弧病毒刺激規(guī)律相似。本研究表明,櫻桃谷肉鴨中存在irf1和irf2這兩個轉錄調節(jié)因子,且在健康鴨組織中廣泛分布。在不同類型的病毒感染櫻桃谷肉鴨后,irf1和irf2在大腦和脾臟中的表達量均上調,這表明這兩個因子參與宿主的抗病毒反應。本項目的研究工作為進一步探究鴨IRF1和IRF2的抗病毒作用機理奠定了基礎,有助于進一步認識鴨的先天性免疫系統(tǒng)。
【圖文】：

transactivation domain和enhance domain（如圖1所示）DU represent Cherry valley duck; CK represent Gallus; HU represent Homo sapiens; MS represent Mus musculus圖1. 干擾素調節(jié)因子調節(jié)因子1的氨基酸對比結構Fig.1 AA contrast structure of IRF1IRF2的ORF全長序列1047bp,編碼348個氨基酸。IRF2的蛋白序列包括4個區(qū)域，包括DNA binding domain 、Transacivating domain、Interferon Associate domain 2和Repression motif。（如圖2）

19DU represent Cherry valley duck; CK represent Gallus; HU represent Homo sapiens; MS represent Mus musculus圖2 干擾素調節(jié)因子調節(jié)因子2的氨基酸對比結構Fig.2 AA contrast structure of IRF23.2 櫻桃谷肉鴨 IRF1 和 IRF2 的進化樹分析櫻桃谷肉鴨IRF1和IRF2與其它已知序列IRF1和IRF2序列的高度相似性由進化樹進一步支持。進化樹是由25個來自哺乳類、鳥類、魚類、爬行類的IRF1蛋白序列和IRF2進行構建的。如圖3、圖4所示，櫻桃谷肉鴨IRF1和IRF2與同是鳥類的鴻雁、鴿子和原雞的IRF1和IRF2同源性最高，，而與親緣關系較遠的哺乳類以及魚類IRF1和IRF2同源性較低。（進化樹構建所用序列見表2）
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.32

【參考文獻】

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本文編號：2580585