【摘要】：油菜是全世界主要農(nóng)作物之一,是食用植物油和飼用蛋白質(zhì)的重要來源,其工業(yè)用途也十分廣泛。雜種優(yōu)勢利用對油菜產(chǎn)量的提高起到了重要推動作用,在雜種優(yōu)勢利用途徑中雄性不育的利用是主要途徑之一,細胞核雄性不育系9012A及其衍生系已經(jīng)被廣泛應用于油菜雜交種商業(yè)化制種,其雄性不育性狀由Bn Ms3和Bn Rf兩個位點控制。為解析9012A雄性不育及其育性恢復的分子機理,恢復基因Bn Ms3已經(jīng)被成功克隆,其編碼的蛋白與葉綠體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白Tic40同源;前人對Bn Rf位點已經(jīng)精細定位,并通過BAC測序得到了臨保系中等位基因Bn Rf c的候選區(qū)間。本研究在前人研究的基礎上,進一步發(fā)現(xiàn)不育系和恢復系中Bn Rf候選區(qū)間序列與臨保系參考序列差異很大。為獲得不育系和恢復系中Bn Rf候選區(qū)間真實序列,構(gòu)建了包含Bn Rf位點不育基因BnRf~b和恢復基因Bn Rf a的BAC克隆文庫,通過測序分別得到了包含BnRf~b和Bn Rf a的候選區(qū)間序列,揭示了不育系和恢復系材料在Bn Rf位點復雜的染色體結(jié)構(gòu)變異。同時,通過分析RG206AB和RG250AB兩個不同遺傳背景的定位群體,本研究對Bn Rf位點育性控制基因進行了進一步精細定位,并完成了不育基因的克隆與功能驗證。主要研究結(jié)果如下:1、本研究構(gòu)建了一個甘藍型油菜基因組BAC文庫,篩選得到了分別包含Bn Rf a和BnRf~b的BAC單克隆。序列分析發(fā)現(xiàn),相對于臨保系,不育系和恢復系在Bn Rf位點存在一個大片段插入以及一個局部序列的倒位,Bn Rf基因在恢復系的定位區(qū)間實際為58.1 Kb,在不育系中相對應的區(qū)間為63.1 Kb。2、根據(jù)不育系和恢復系中Bn Rf候選區(qū)間的序列差異,新開發(fā)了8個分子標記,通過分析RG206AB和RG250AB兩個定位群體,最終將Bn Rf a限定到35.9 Kb的物理區(qū)間內(nèi),預測包含7個開放閱讀框(ORF)。3、候選基因G14在不育系和恢復系中的等位基因,在啟動子區(qū)域存在兩個插入缺失變異,最有可能是目標基因。本研究通過農(nóng)桿菌介導將包含不育系來源G14全長的基因組片段AGS14-1轉(zhuǎn)化到遺傳背景為Bnms3的野生型擬南芥中,獲得了27株轉(zhuǎn)基因陽性單株。表型調(diào)查發(fā)現(xiàn)27個陽性單株都表現(xiàn)為花絲短小,花藥皺縮,沒有可育花粉,其雄性不育表型與RG206A十分相似;T1代陽性單株與野生型雜交,在T2代分離群體中,雄性不育表型與AGS14-1轉(zhuǎn)基因片段共分離。進一步的細胞學觀察表明,不育擬南芥與RG206A花藥的異常發(fā)育過程也基本相同。不僅如此,外源導入Bn Ms3還能夠徹底恢復AGS14-1導致的擬南芥雄性不育,這與甘藍型油菜中Bn Ms3能夠特異性恢復9012A類型不育系的育性相一致。因此,可以確認基因組片段AGS14-1包含導致RG206A產(chǎn)生雄性不育的BnRf~b基因。4、將恢復系中與AGS14-1等位的基因組片段AGS14-2導入擬南芥野生型,轉(zhuǎn)基因陽性單株也均表現(xiàn)為雄性不育,因此恢復系來源的基因組片段AGS14-2可能也包含雄性不育基因BnRf~b。因而推測,Bn Rf位點恢復基因Bn Rf a與不育基因BnRf~b可能并不等位,恢復基因可能對應于35.9 Kb候選區(qū)段內(nèi)的另一個基因。5、AGS14-1和AGS14-2片段上都包含預測的開放閱讀框G14,其蛋白編碼序列完全相同。通過PCR從RG206H花藥c DNA文庫中擴增獲得的G14全長CDS包含9個外顯子,編碼一個1386個氨基酸的蛋白。DNA水平和蛋白水平的同源性分析表明G14是一個嵌合基因,由3段與不同基因同源的序列組成。由于G14中較大一段序列與mt HSP70-1高度同源,因此我們將G14命名為Bna A7.mt HSP70-1-like。在可育材料RG206H中,Bna A7.mt HSP70-1-like在花藥發(fā)育的整個過程中持續(xù)表達,在減數(shù)分裂時期其表達水平較高;而在不育材料RG206A中,Bna A7.mt HSP70-1-like僅在花藥發(fā)育的減數(shù)分裂時期有微弱表達。6、油菜核不育基因Bna A7.mt HSP70-1-like在擬南芥中異位表達,對絨氈層分化相關基因沒有明顯影響,但卻明顯抑制了絨氈層退化相關基因的表達。與此相一致,在油菜不育系RG206A中我們觀察到絨氈層細胞的PCD明顯延遲。7、在公用數(shù)據(jù)庫中的序列比對分析,僅在甘藍參考基因組上找到一個Bna A7.mt HSP70-1-like基因的同源基因,擬南芥及其他物種中均沒有該嵌合基因的同源基因。甘藍型油菜和白菜參考基因組上也不存在Bna A7.mt HSP70-1-like或其同源基因,但本研究對190份甘藍型油菜及24份白菜材料進行分析,其中有52份甘藍型油菜及20份白菜材料包含Bna A7.mt HSP70-1-like基因。
【圖文】：

圖 1.19012A 類型細胞核雄性不育系三系化制種模式（Dong et al., 2012）Fig.1.1 Schematic diagram of three-line breeding process for the recessive nuclear male sterility（Dong et al., 2012）1.1.2 9012A 不育系雄性不育相關基因的定位柯麗萍等以9012AB為研究材料，應用BSA法構(gòu)建了可育基因池和不育基因池，篩選得到了 7 個與 Bnms3 基因緊密連鎖的分子標記，通過對 1506 個單株的近等基因系群體分析，將目標基因定位在 0.5 cM 的遺傳距離內(nèi)，，實現(xiàn)了對 Bnms3 基因的精細定位（柯麗萍，2005；Ke et al., 2005）。何俊平等通過緊密連鎖分子標記的序列比對分析，在擬南芥第五染色體上找到了 Bnms3 定位區(qū)間的同源區(qū)段，結(jié)合油菜、甘藍和白菜的ESTs、GSSs序列，開發(fā)出了6個與 Bnms3 基因緊密連鎖的ACGM 標記，最終將目標基因的定位區(qū)間進一步縮小到了 0.034cM 的遺傳距離內(nèi)（He et al., 2008Huang 等則以近等基因系群體 7-7365AB 為材料，將 Bnms3 基因定位在甘藍型油菜N19 連鎖群（Huang et al., 2007）。Dun 等根據(jù)甘藍型油菜定位區(qū)間與擬南芥序列的

圖 1.2 葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運的修正模型Fig.1.2 Model for the protein import in chloroplast（Nakai, 2015）1.2.3 Tic40 可能與質(zhì)體內(nèi)脂類合成相關高等植物中飽和脂肪酸的合成在葉綠體基質(zhì)中進行，葉綠體內(nèi)膜在脂類合成中也發(fā)揮著重要作用。絨氈層中特化的質(zhì)體結(jié)構(gòu)——造油體，富含由單半乳糖甘油二脂、甘油三酯、甾醇酯等脂類組成的油滴，在小孢子發(fā)育后期絨氈層細胞裂解后，為花粉外壁合成提供必不可少的脂類物質(zhì)。在修正的葉綠體內(nèi)膜蛋白轉(zhuǎn)運模型中，Tic40 并未參與內(nèi)膜蛋白轉(zhuǎn)運子的組成，因此 Tic40 的真實功能值得重新考慮。也許 Tic40 確實是作為葉綠體基質(zhì)中分子伴侶蛋白結(jié)合在內(nèi)膜上的支架，在蛋白跨膜過程的晚期參與到葉綠體內(nèi)膜蛋白轉(zhuǎn)運（Land Chiu, 2010）。但也有可能，Tic40 并不直接參與葉綠體內(nèi)膜蛋白轉(zhuǎn)運過程，而是在質(zhì)體形成的其它環(huán)節(jié)發(fā)揮重要功能從而間接影響葉綠體的蛋白轉(zhuǎn)運能力。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S565.4

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 錢章強;細胞核雄性不育的保持和利用[J];種子;1990年02期

2 付偉;馬小軍;唐其;蘭金旭;;我國植物細胞核雄性不育基因研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2010年17期

3 陳鳳祥,周立人,李展;植物細胞核雄性不育保持途徑研究進展(綜述)[J];安徽農(nóng)業(yè)大學學報;1997年01期

4 張潔夫,傅壽仲,戚存扣,浦惠明,陳新軍,高建芹;細胞核雄性不育雜交油菜選育研究初報[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學;2002年01期

5 刁現(xiàn)民,智慧;粟細胞核雄性不育和雄性可育花藥發(fā)育的細胞形態(tài)學研究[J];華北農(nóng)學報;1989年S1期

6 諶國鵬;王風敏;李英;郝興順;范小平;孫曉敏;張秀英;馮志峰;習廣清;;我國甘藍型油菜細胞核雄性不育利用的途徑[J];中國種業(yè);2010年08期

7 李維平,張建國,葛世敏,楊驅(qū)虎;玉米細胞核雄性不育基因利用新途徑[J];中國農(nóng)學通報;1998年03期

8 諶國鵬;王風敏;李英;范小平;賈哲;馮志峰;郝興順;習廣清;;我國甘藍型油菜細胞核雄性不育利用的途徑[J];陜西農(nóng)業(yè)科學;2010年04期

9 張建奎;董靜;余國東;宗學鳳;李伯群;;光照強度對溫光敏細胞核雄性不育小麥育性的影響[J];植物遺傳資源學報;2011年02期

10 張建豐;張戰(zhàn)奇;宇文璞;;棉花單隱性光溫敏細胞核雄性不育系芽黃396A[J];農(nóng)業(yè)科技通訊;2006年04期

相關會議論文 前4條

1 樊云芳;胡勝武;董彩華;郭學蘭;劉勝毅;;甘藍型油菜雙隱性細胞核雄性不育的細胞學及育性相關基因的差異表達研究[A];湖北省遺傳學會、江西省遺傳學會2006年學術(shù)年會暨學術(shù)討論會論文摘要集[C];2006年

2 周寬基;王世紅;劉忠祥;馮毓琴;張永生;袁明璐;王根軒;;作物細胞核雄性不育雜種優(yōu)勢利用的NX-ms模式[A];2003年全國作物遺傳育種學術(shù)研討會論文集[C];2003年

3 張新;陳國平;周瑞陽;;陸地棉細胞核雄性不育系洞A的二年生栽培初探[A];中國棉花學會2008年年會論文匯編[C];2008年

4 葉紈芝;曹家樹;余小林;向s

本文編號：2575448