【摘要】：油菜是全世界主要農(nóng)作物之一,是食用植物油和飼用蛋白質(zhì)的重要來源,其工業(yè)用途也十分廣泛。雜種優(yōu)勢利用對油菜產(chǎn)量的提高起到了重要推動作用,在雜種優(yōu)勢利用途徑中雄性不育的利用是主要途徑之一,細(xì)胞核雄性不育系9012A及其衍生系已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于油菜雜交種商業(yè)化制種,其雄性不育性狀由Bn Ms3和Bn Rf兩個(gè)位點(diǎn)控制。為解析9012A雄性不育及其育性恢復(fù)的分子機(jī)理,恢復(fù)基因Bn Ms3已經(jīng)被成功克隆,其編碼的蛋白與葉綠體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Tic40同源;前人對Bn Rf位點(diǎn)已經(jīng)精細(xì)定位,并通過BAC測序得到了臨保系中等位基因Bn Rf c的候選區(qū)間。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)不育系和恢復(fù)系中Bn Rf候選區(qū)間序列與臨保系參考序列差異很大。為獲得不育系和恢復(fù)系中Bn Rf候選區(qū)間真實(shí)序列,構(gòu)建了包含Bn Rf位點(diǎn)不育基因BnRf~b和恢復(fù)基因Bn Rf a的BAC克隆文庫,通過測序分別得到了包含BnRf~b和Bn Rf a的候選區(qū)間序列,揭示了不育系和恢復(fù)系材料在Bn Rf位點(diǎn)復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)變異。同時(shí),通過分析RG206AB和RG250AB兩個(gè)不同遺傳背景的定位群體,本研究對Bn Rf位點(diǎn)育性控制基因進(jìn)行了進(jìn)一步精細(xì)定位,并完成了不育基因的克隆與功能驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:1、本研究構(gòu)建了一個(gè)甘藍(lán)型油菜基因組BAC文庫,篩選得到了分別包含Bn Rf a和BnRf~b的BAC單克隆。序列分析發(fā)現(xiàn),相對于臨保系,不育系和恢復(fù)系在Bn Rf位點(diǎn)存在一個(gè)大片段插入以及一個(gè)局部序列的倒位,Bn Rf基因在恢復(fù)系的定位區(qū)間實(shí)際為58.1 Kb,在不育系中相對應(yīng)的區(qū)間為63.1 Kb。2、根據(jù)不育系和恢復(fù)系中Bn Rf候選區(qū)間的序列差異,新開發(fā)了8個(gè)分子標(biāo)記,通過分析RG206AB和RG250AB兩個(gè)定位群體,最終將Bn Rf a限定到35.9 Kb的物理區(qū)間內(nèi),預(yù)測包含7個(gè)開放閱讀框(ORF)。3、候選基因G14在不育系和恢復(fù)系中的等位基因,在啟動子區(qū)域存在兩個(gè)插入缺失變異,最有可能是目標(biāo)基因。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將包含不育系來源G14全長的基因組片段AGS14-1轉(zhuǎn)化到遺傳背景為Bnms3的野生型擬南芥中,獲得了27株轉(zhuǎn)基因陽性單株。表型調(diào)查發(fā)現(xiàn)27個(gè)陽性單株都表現(xiàn)為花絲短小,花藥皺縮,沒有可育花粉,其雄性不育表型與RG206A十分相似;T1代陽性單株與野生型雜交,在T2代分離群體中,雄性不育表型與AGS14-1轉(zhuǎn)基因片段共分離。進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)觀察表明,不育擬南芥與RG206A花藥的異常發(fā)育過程也基本相同。不僅如此,外源導(dǎo)入Bn Ms3還能夠徹底恢復(fù)AGS14-1導(dǎo)致的擬南芥雄性不育,這與甘藍(lán)型油菜中Bn Ms3能夠特異性恢復(fù)9012A類型不育系的育性相一致。因此,可以確認(rèn)基因組片段AGS14-1包含導(dǎo)致RG206A產(chǎn)生雄性不育的BnRf~b基因。4、將恢復(fù)系中與AGS14-1等位的基因組片段AGS14-2導(dǎo)入擬南芥野生型,轉(zhuǎn)基因陽性單株也均表現(xiàn)為雄性不育,因此恢復(fù)系來源的基因組片段AGS14-2可能也包含雄性不育基因BnRf~b。因而推測,Bn Rf位點(diǎn)恢復(fù)基因Bn Rf a與不育基因BnRf~b可能并不等位,恢復(fù)基因可能對應(yīng)于35.9 Kb候選區(qū)段內(nèi)的另一個(gè)基因。5、AGS14-1和AGS14-2片段上都包含預(yù)測的開放閱讀框G14,其蛋白編碼序列完全相同。通過PCR從RG206H花藥c DNA文庫中擴(kuò)增獲得的G14全長CDS包含9個(gè)外顯子,編碼一個(gè)1386個(gè)氨基酸的蛋白。DNA水平和蛋白水平的同源性分析表明G14是一個(gè)嵌合基因,由3段與不同基因同源的序列組成。由于G14中較大一段序列與mt HSP70-1高度同源,因此我們將G14命名為Bna A7.mt HSP70-1-like。在可育材料RG206H中,Bna A7.mt HSP70-1-like在花藥發(fā)育的整個(gè)過程中持續(xù)表達(dá),在減數(shù)分裂時(shí)期其表達(dá)水平較高;而在不育材料RG206A中,Bna A7.mt HSP70-1-like僅在花藥發(fā)育的減數(shù)分裂時(shí)期有微弱表達(dá)。6、油菜核不育基因Bna A7.mt HSP70-1-like在擬南芥中異位表達(dá),對絨氈層分化相關(guān)基因沒有明顯影響,但卻明顯抑制了絨氈層退化相關(guān)基因的表達(dá)。與此相一致,在油菜不育系RG206A中我們觀察到絨氈層細(xì)胞的PCD明顯延遲。7、在公用數(shù)據(jù)庫中的序列比對分析,僅在甘藍(lán)參考基因組上找到一個(gè)Bna A7.mt HSP70-1-like基因的同源基因,擬南芥及其他物種中均沒有該嵌合基因的同源基因。甘藍(lán)型油菜和白菜參考基因組上也不存在Bna A7.mt HSP70-1-like或其同源基因,但本研究對190份甘藍(lán)型油菜及24份白菜材料進(jìn)行分析,其中有52份甘藍(lán)型油菜及20份白菜材料包含Bna A7.mt HSP70-1-like基因。
【圖文】：

圖 1.19012A 類型細(xì)胞核雄性不育系三系化制種模式（Dong et al., 2012）Fig.1.1 Schematic diagram of three-line breeding process for the recessive nuclear male sterility（Dong et al., 2012）1.1.2 9012A 不育系雄性不育相關(guān)基因的定位柯麗萍等以9012AB為研究材料，應(yīng)用BSA法構(gòu)建了可育基因池和不育基因池，篩選得到了 7 個(gè)與 Bnms3 基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過對 1506 個(gè)單株的近等基因系群體分析，將目標(biāo)基因定位在 0.5 cM 的遺傳距離內(nèi)，，實(shí)現(xiàn)了對 Bnms3 基因的精細(xì)定位（柯麗萍，2005；Ke et al., 2005）。何俊平等通過緊密連鎖分子標(biāo)記的序列比對分析，在擬南芥第五染色體上找到了 Bnms3 定位區(qū)間的同源區(qū)段，結(jié)合油菜、甘藍(lán)和白菜的ESTs、GSSs序列，開發(fā)出了6個(gè)與 Bnms3 基因緊密連鎖的ACGM 標(biāo)記，最終將目標(biāo)基因的定位區(qū)間進(jìn)一步縮小到了 0.034cM 的遺傳距離內(nèi)（He et al., 2008Huang 等則以近等基因系群體 7-7365AB 為材料，將 Bnms3 基因定位在甘藍(lán)型油菜N19 連鎖群（Huang et al., 2007）。Dun 等根據(jù)甘藍(lán)型油菜定位區(qū)間與擬南芥序列的

圖 1.2 葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的修正模型Fig.1.2 Model for the protein import in chloroplast（Nakai, 2015）1.2.3 Tic40 可能與質(zhì)體內(nèi)脂類合成相關(guān)高等植物中飽和脂肪酸的合成在葉綠體基質(zhì)中進(jìn)行，葉綠體內(nèi)膜在脂類合成中也發(fā)揮著重要作用。絨氈層中特化的質(zhì)體結(jié)構(gòu)——造油體，富含由單半乳糖甘油二脂、甘油三酯、甾醇酯等脂類組成的油滴，在小孢子發(fā)育后期絨氈層細(xì)胞裂解后，為花粉外壁合成提供必不可少的脂類物質(zhì)。在修正的葉綠體內(nèi)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)模型中，Tic40 并未參與內(nèi)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)子的組成，因此 Tic40 的真實(shí)功能值得重新考慮。也許 Tic40 確實(shí)是作為葉綠體基質(zhì)中分子伴侶蛋白結(jié)合在內(nèi)膜上的支架，在蛋白跨膜過程的晚期參與到葉綠體內(nèi)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)（Land Chiu, 2010）。但也有可能，Tic40 并不直接參與葉綠體內(nèi)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程，而是在質(zhì)體形成的其它環(huán)節(jié)發(fā)揮重要功能從而間接影響葉綠體的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S565.4

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本文編號：2575448