【摘要】：本研究是以油棕葉片基因組DNA為模板,通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的油棕脫飽和酶基因ω3的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異性引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增及TA克隆的方法得到了長(zhǎng)度為1 144 bp油棕脫飽和酶基因ω3啟動(dòng)子序列。通過(guò)Plant CARE軟件分析該序列的順式作用元件,發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子不僅含有轉(zhuǎn)錄必備的CAAT-box和TATA box,還有大量相關(guān)的光反應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件。通過(guò)構(gòu)建含gus的植物表達(dá)載體,農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因擬南芥,對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行活性表達(dá)分析。結(jié)果表明:克隆獲得的啟動(dòng)子序列和下游gus基因已經(jīng)穩(wěn)定的整合到獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組當(dāng)中;同時(shí),gus基因在擬南芥不同組織中體現(xiàn)出明顯的組織特異性,其中,莖干處表達(dá)量最高,在葉片的葉脈處表達(dá)次之。說(shuō)明ω3啟動(dòng)子具有活性,可以啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄,本研究為進(jìn)一步研究啟動(dòng)子的功能及基因表達(dá)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖1ω-3啟動(dòng)子克隆注:M:DS5000Marker;1~3:ω-3啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物Figure1thecloneofω-3promoterNote:M:DS5000Marker;1~3:PCRamplificationofω-3pro-moter此故有“世界油王”之稱(Zeven,1964)。ω-3脂肪酸脫飽和酶是一種脂酰一脂脫飽和酶，存在于植物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、質(zhì)體膜以及藍(lán)藻的類囊體膜上，作用位置存在于ω-3。ω-3脂肪酸脫飽和酶的底物是與載體結(jié)合的不飽和脂肪酸，作用是催化與甘油脂結(jié)合的二烯脂肪酸形成第三個(gè)雙鍵(劉訓(xùn)言等,2004)。ω-3脂肪酸脫飽和酶基因是催化十六碳二烯酸(16:2)或十八碳二烯酸(18:2)(BrowseandSomerville,1991)轉(zhuǎn)化為十六碳三烯酸(16:3或十八碳三烯酸(18:30)(李慧等,2012)的關(guān)鍵酶基因。自從1992年Arondel等(1992)成功克隆了擬南芥內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ω-3脂肪酸脫飽和酶基因以來(lái)，，人們又陸續(xù)克隆了豇豆(Yamamotoetal.,1992)、油菜(Yadavetal.,1993)大豆、擬南芥(質(zhì)體)、蓖麻(Vanetal.,1992)、小白花和小麥等的微體和質(zhì)體的ω-3脂肪酸脫飽和酶基因。近年來(lái)，人們研究ω-3脂肪酸脫飽和酶基因也愈來(lái)愈深入，Murakami等(2000)通過(guò)基因工程手段使煙草中編碼ω-3脂肪酸脫飽和酶的基因保持沉默，從而導(dǎo)致了與野生型植株中的三烯脂肪酸含量相比，突變植株明顯減少，而且突變株能更好地適應(yīng)高溫的生長(zhǎng)環(huán)境。Horiguchi等(2000)研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)在30℃和10℃條件下的小麥，其根尖中總脂肪酸中C18:3所占比例分別為22%和55%。小麥根尖中α一亞麻酸占總脂肪酸的比例隨生長(zhǎng)溫度的降低而升高的直接原因是小麥TaFad3(小麥內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ω-3脂肪酸脫飽和酶基因)蛋白量的增長(zhǎng)。Zhang等(2005)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型FAD3基因轉(zhuǎn)入煙草中，可以不同程度的提高轉(zhuǎn)基因植株的抗干旱能力。然而

分子植物育種MolecularPlantBreeding圖6轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定注:M:DS5000Marker;W:野生型擬南芥;1~10:轉(zhuǎn)基因擬南芥Figure6PCRidentificationoftransgenicArabidopsisNote:M:DS5000Marker;W:WildArabidopsis;1~10:Trans-genicArabidopsis圖5轉(zhuǎn)基因擬南芥在潮霉素上的篩選注:A:在含有潮霉素的培養(yǎng)基上篩選的植株;B:在無(wú)抗培養(yǎng)基上的植株Figure5ScreeningofthetransgenicArabidopsisinHygromycinmediumNote:A:ScreeningoftheplantsinHygromycinmedium;B:inabsenceofmediumresistanceofplants圖4ω-3啟動(dòng)子酶切鑒定注:M:DS5000Marker;1~3:ω-3-1300啟動(dòng)子的酶切鑒定產(chǎn)物Figure4Theidentificationofω-3-1300sbyrestrictionenzymesdigestionNote:M:DS5000Marker;1~3:Theidentificationofω-3-1300sbyrestrictionenzymesdigestionamplification取T2代成功進(jìn)行GUS染色的轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉、花、果莢、進(jìn)行提取GUS蛋白進(jìn)行GUS活性測(cè)定及定量分析(圖8)，分析結(jié)果顯示，ω3啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的莖的部位活性最高，在葉片處表達(dá)活性次之，在根、花、果莢處活性較弱，幾乎不表達(dá)。2討論在高等植物中，植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、生理代謝及響應(yīng)的過(guò)程中，基因的表達(dá)調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中進(jìn)行的。該過(guò)程是受到多種的順式元件，以及反式因子之間的相互協(xié)調(diào)共同作用。啟動(dòng)子是一段能與RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合，并決定轉(zhuǎn)錄因子的起始的序列(李杰等,2006)，在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，它能夠決定轉(zhuǎn)錄的方向和轉(zhuǎn)錄的效率，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心，也是基因工程表達(dá)載體的一個(gè)重要元件�；蚬こ讨谐Ｓ玫膯�(dòng)子主要有三類：組成型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(張春曉等,2004)和組織特異?

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