【摘要】：本研究是以油棕葉片基因組DNA為模板,通過數(shù)據(jù)庫預測的油棕脫飽和酶基因ω3的啟動子序列設計特異性引物,利用PCR技術擴增及TA克隆的方法得到了長度為1 144 bp油棕脫飽和酶基因ω3啟動子序列。通過Plant CARE軟件分析該序列的順式作用元件,發(fā)現(xiàn)該啟動子不僅含有轉錄必備的CAAT-box和TATA box,還有大量相關的光反應元件和激素響應元件。通過構建含gus的植物表達載體,農(nóng)桿菌介導轉化轉基因擬南芥,對轉基因擬南芥進行活性表達分析。結果表明:克隆獲得的啟動子序列和下游gus基因已經(jīng)穩(wěn)定的整合到獲得的轉基因擬南芥基因組當中;同時,gus基因在擬南芥不同組織中體現(xiàn)出明顯的組織特異性,其中,莖干處表達量最高,在葉片的葉脈處表達次之。說明ω3啟動子具有活性,可以啟動目的基因的轉錄,本研究為進一步研究啟動子的功能及基因表達調控奠定了基礎。
【圖文】：

圖1ω-3啟動子克隆注:M:DS5000Marker;1~3:ω-3啟動子PCR產(chǎn)物Figure1thecloneofω-3promoterNote:M:DS5000Marker;1~3:PCRamplificationofω-3pro-moter此故有“世界油王”之稱(Zeven,1964)。ω-3脂肪酸脫飽和酶是一種脂酰一脂脫飽和酶，存在于植物的內(nèi)質網(wǎng)膜、質體膜以及藍藻的類囊體膜上，作用位置存在于ω-3。ω-3脂肪酸脫飽和酶的底物是與載體結合的不飽和脂肪酸，作用是催化與甘油脂結合的二烯脂肪酸形成第三個雙鍵(劉訓言等,2004)。ω-3脂肪酸脫飽和酶基因是催化十六碳二烯酸(16:2)或十八碳二烯酸(18:2)(BrowseandSomerville,1991)轉化為十六碳三烯酸(16:3或十八碳三烯酸(18:30)(李慧等,2012)的關鍵酶基因。自從1992年Arondel等(1992)成功克隆了擬南芥內(nèi)質網(wǎng)ω-3脂肪酸脫飽和酶基因以來，，人們又陸續(xù)克隆了豇豆(Yamamotoetal.,1992)、油菜(Yadavetal.,1993)大豆、擬南芥(質體)、蓖麻(Vanetal.,1992)、小白花和小麥等的微體和質體的ω-3脂肪酸脫飽和酶基因。近年來，人們研究ω-3脂肪酸脫飽和酶基因也愈來愈深入，Murakami等(2000)通過基因工程手段使煙草中編碼ω-3脂肪酸脫飽和酶的基因保持沉默，從而導致了與野生型植株中的三烯脂肪酸含量相比，突變植株明顯減少，而且突變株能更好地適應高溫的生長環(huán)境。Horiguchi等(2000)研究發(fā)現(xiàn)，生長在30℃和10℃條件下的小麥，其根尖中總脂肪酸中C18:3所占比例分別為22%和55%。小麥根尖中α一亞麻酸占總脂肪酸的比例隨生長溫度的降低而升高的直接原因是小麥TaFad3(小麥內(nèi)質網(wǎng)ω-3脂肪酸脫飽和酶基因)蛋白量的增長。Zhang等(2005)研究發(fā)現(xiàn)，通過將內(nèi)質網(wǎng)型FAD3基因轉入煙草中，可以不同程度的提高轉基因植株的抗干旱能力。然而

分子植物育種MolecularPlantBreeding圖6轉基因擬南芥的PCR鑒定注:M:DS5000Marker;W:野生型擬南芥;1~10:轉基因擬南芥Figure6PCRidentificationoftransgenicArabidopsisNote:M:DS5000Marker;W:WildArabidopsis;1~10:Trans-genicArabidopsis圖5轉基因擬南芥在潮霉素上的篩選注:A:在含有潮霉素的培養(yǎng)基上篩選的植株;B:在無抗培養(yǎng)基上的植株Figure5ScreeningofthetransgenicArabidopsisinHygromycinmediumNote:A:ScreeningoftheplantsinHygromycinmedium;B:inabsenceofmediumresistanceofplants圖4ω-3啟動子酶切鑒定注:M:DS5000Marker;1~3:ω-3-1300啟動子的酶切鑒定產(chǎn)物Figure4Theidentificationofω-3-1300sbyrestrictionenzymesdigestionNote:M:DS5000Marker;1~3:Theidentificationofω-3-1300sbyrestrictionenzymesdigestionamplification取T2代成功進行GUS染色的轉基因植株的根、莖、葉、花、果莢、進行提取GUS蛋白進行GUS活性測定及定量分析(圖8)，分析結果顯示，ω3啟動子在轉基因擬南芥中的莖的部位活性最高，在葉片處表達活性次之，在根、花、果莢處活性較弱，幾乎不表達。2討論在高等植物中，植物的生長、發(fā)育、生理代謝及響應的過程中，基因的表達調控主要是在轉錄過程中進行的。該過程是受到多種的順式元件，以及反式因子之間的相互協(xié)調共同作用。啟動子是一段能與RNA聚合酶及轉錄因子特異性結合，并決定轉錄因子的起始的序列(李杰等,2006)，在調控基因轉錄環(huán)節(jié)中起著關鍵作用，它能夠決定轉錄的方向和轉錄的效率，是轉錄調控的中心，也是基因工程表達載體的一個重要元件。基因工程中常用的啟動子主要有三類：組成型啟動子，誘導型啟動子(張春曉等,2004)和組織特異?

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