【摘要】：赤潮是當(dāng)前全球性的海洋環(huán)境熱點(diǎn)問(wèn)題。東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)是我國(guó)近海海域常見(jiàn)的赤潮藻種,當(dāng)前對(duì)東海原甲藻在各種脅迫環(huán)境下的分子適應(yīng)機(jī)制研究不夠深入。本文主要對(duì)東海原甲藻的兩種重要基因—熱激蛋白90(Heat Shock Protein 90,HSP90)和視紫紅質(zhì)進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析,以期增加對(duì)東海原甲藻在各種環(huán)境條件下的分子適應(yīng)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。HSP90是一種分子伴侶,在幫助蛋白質(zhì)折疊、維持蛋白結(jié)構(gòu)完整以及保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境脅迫等方面具有重要作用。以前期獲得的部分HSP90基因序列為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增引物,通過(guò)c DNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of c DNA Ends,RACE)技術(shù)獲得了HSP90的5'端和3'端,將5'端和3'端序列進(jìn)行拼接,得到了2 443 bp的全長(zhǎng)cDNA。將序列提交至Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù),得到的入口號(hào)為KX899924。東海原甲藻HSP90基因的全長(zhǎng)c DNA序列包括1個(gè)111 bp的5′-UTR,1個(gè)199 bp的3′-UTR并含有一個(gè)poly(A)尾巴,ORF的長(zhǎng)度為2 133 bp。ORF編碼711個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)氨基酸的等電點(diǎn)為4.95,分子量為85.81 k Da。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示,東海原甲藻HSP90屬于甲藻屬,并與Gen Bank中的Prorocentrum minimun(Accession No.ADP65795.1)和Prorocentrum micans(Accession No.AAR27546.1)的HSP90關(guān)系較近。熒光定量PCR結(jié)果表明:在溫度脅迫下,HSP90的相對(duì)表達(dá)量在10℃時(shí)達(dá)到最大,并與20℃相比有顯著差異(P0.05),在20℃以下時(shí),HSP90的表達(dá)量隨著溫度升高而逐漸降低,在溫度高于20℃時(shí),HSP90的表達(dá)量隨著溫度升高而升高;在氮脅迫下,氮濃度在88μM時(shí)HSP90的相對(duì)表達(dá)量最大,并與對(duì)照組(氮濃度為880μM)有顯著差異(P0.05);在磷脅迫下,磷濃度在3.6μM時(shí)HSP90的相對(duì)表達(dá)量最大,并與對(duì)照組(磷濃度為36.0μM)有顯著差異(P0.05),隨著氮或磷濃度的降低,HSP90的表達(dá)量都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);在銅離子脅迫下,銅離子濃度在31.25μM時(shí)HSP90的相對(duì)表達(dá)量最大,并與對(duì)照組(銅離子濃度為0μM)有顯著差異(P0.05),HSP90的相對(duì)表達(dá)量在達(dá)到最大值10.81倍后又降低到最小值3.04倍。上述結(jié)果說(shuō)明,溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽和重金屬等脅迫條件可以致使HSP90大量表達(dá)以對(duì)抗環(huán)境脅迫帶來(lái)的負(fù)面影響。視紫紅質(zhì)的主要功能是捕獲光能并將其轉(zhuǎn)化為其他能量,該基因在原甲藻中研究甚少,其對(duì)不同光譜和光強(qiáng)的轉(zhuǎn)化機(jī)制尚未清楚。以前期獲得的部分視紫紅質(zhì)基因序列為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)了特異性引物,通過(guò)RACE技術(shù)獲得了視紫紅質(zhì)的5'端和3'端,將5'端和3'端序列進(jìn)行拼接,得到了1 104 bp的全長(zhǎng)c DNA。將該序列提交至Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù),得到的入口號(hào)為KY399746。東海原甲藻視紫紅質(zhì)基因c DNA序列包含1個(gè)106 bp的5′-UTR,1個(gè)221 bp的3′-UTR并含有一個(gè)poly(A)尾巴,ORF的長(zhǎng)度為777 bp。ORF編碼259個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)氨基酸的等電點(diǎn)為5.83,分子量為28.79 k Da。系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),東海原甲藻的視紫紅質(zhì)基因與Gen Bank中的Pseudo-nitzschia granii(Accession No.AJA37445.1)的視紫紅質(zhì)基因基因在同一分支,親緣關(guān)系較近。熒光定量PCR結(jié)果顯示:在持續(xù)光照循環(huán)中,視紫紅質(zhì)基因的表達(dá)量隨光照時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì);在持續(xù)黑暗循環(huán)中,視紫紅質(zhì)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì),且各組與對(duì)照組均有顯著差異(P0.05);在暗亮光照循環(huán)中,視紫紅質(zhì)基因的表達(dá)量在黑暗條件下逐漸降低,恢復(fù)光照后表達(dá)量又急速上升;在紅光、藍(lán)光和綠光照射下,視紫紅質(zhì)基因的表達(dá)量在綠色光照組表達(dá)量最高,且藍(lán)光、綠光均與白光(對(duì)照組)有顯著差異(P0.05);在磷脅迫下,視紫紅質(zhì)的表達(dá)量隨著磷濃度降低而減少,當(dāng)磷濃度低于7.2μM時(shí),視紫紅質(zhì)的表達(dá)量與對(duì)照組均有顯著差異(P0.05)。進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建視紫紅質(zhì)基因的重組表達(dá)載體,制備視紫紅質(zhì)蛋白重組表達(dá)菌株,并用其對(duì)該蛋白的光譜特性進(jìn)行初步分析,發(fā)現(xiàn)視紫紅質(zhì)蛋白在320 nm處有最大吸收峰。上述結(jié)果為了解東海原甲藻在環(huán)境脅迫下的適應(yīng)機(jī)制提供了新見(jiàn)解,對(duì)研究其他甲藻的適應(yīng)機(jī)制也有一定的借鑒意義。
【圖文】：

28圖 2-10 內(nèi)參基因 GAPDH 引物的擴(kuò)增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig. 2-10 The amplification plot and standard curve of GAPDH primers

29圖 2-11 HSP90 基因引物的擴(kuò)增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig. 2-11 The amplification plot and standard curve of GAPDH prime溫度脅迫下 HSP90 基因表達(dá)脅迫下 HSP90 基因的相對(duì)表達(dá)量如圖 2-12 所示。其中，20 與對(duì)照組相比，，具有顯著差異（P < 0.05）的是 10 °C 、15 °C10 °C 時(shí)，HSP90 的表達(dá)量達(dá)到最大，是對(duì)照組的 7.6 倍；其次，在這兩個(gè)溫度條件下 HSP90 表達(dá)量接近，并為對(duì)照組的 5.1 在 25 °C 最低，為對(duì)照組的 2.8 倍，并且和對(duì)照組沒(méi)有顯著兩個(gè)極端的溫度條件 10 °C 和 30 °C 雖然沒(méi)有顯著差異（P > 脅迫下 HSP90 表達(dá)量比較多的兩組。溫度兩兩接近的兩組比
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 侯靜;胡成麗;;淺談近年我國(guó)赤潮的發(fā)生概況及防治措施[J];現(xiàn)代交際;2014年06期

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3 洛昊;馬明輝;梁斌;朱容娟;梁雅惠;;中國(guó)近海赤潮基本特征與減災(zāi)對(duì)策[J];海洋通報(bào);2013年05期

4 汪芳;葛蔚;柴超;孟祥霞;;氮磷濃度對(duì)東海原甲藻優(yōu)勢(shì)種群吸附BDE28和BDE47的影響[J];環(huán)境科學(xué);2013年08期

5 Chao Chai;Xundong Yin;Wei Ge;Jinye Wang;;Effects of nitrogen and phosphorus concentrations on the bioaccumulation of polybrominated diphenyl ethers by Prorocentrum donghaiense[J];Journal of Environmental Sciences;2013年02期

6 文斐;孫曉霞;鄭珊;羅璇;馮秋園;孫松;;2011年春、夏季黃、東海葉綠素a和初級(jí)生產(chǎn)力的時(shí)空變化特征[J];海洋與湖沼;2012年03期

7 徐燁;劉雅婷;代文瓊;朱曉媛;陳雪嬌;仵發(fā)靜;智龍;王曼君;;幾種主要的RACE技術(shù)及應(yīng)用[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào);2012年02期

8 王寧;蘭艷黎;王偉武;;變形菌視紫紅質(zhì)十年的回顧與展望[J];生物物理學(xué)報(bào);2010年11期

9 龔良玉;李雁賓;祝陳堅(jiān);王修林;曲寶涵;;生物法治理赤潮的研究進(jìn)展[J];海洋環(huán)境科學(xué);2010年01期

10 鄧光;耿亞洪;胡鴻鈞;齊雨藻;呂頌輝;李中奎;李夜光;;幾種環(huán)境因子對(duì)高生物量赤潮甲藻——東海原甲藻光合作用的影響[J];海洋科學(xué);2009年12期

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1 吳萍;新型表面活性劑改性粘土治理赤潮研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2005年

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1 徐孟雪;無(wú)機(jī)磷脅迫條件下的東海原甲藻差異表達(dá)基因的克隆與分析[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2569636