【摘要】：赤潮是當前全球性的海洋環(huán)境熱點問題。東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)是我國近海海域常見的赤潮藻種,當前對東海原甲藻在各種脅迫環(huán)境下的分子適應機制研究不夠深入。本文主要對東海原甲藻的兩種重要基因—熱激蛋白90(Heat Shock Protein 90,HSP90)和視紫紅質進行了克隆和表達分析,以期增加對東海原甲藻在各種環(huán)境條件下的分子適應機制的認識。HSP90是一種分子伴侶,在幫助蛋白質折疊、維持蛋白結構完整以及保護細胞免受環(huán)境脅迫等方面具有重要作用。以前期獲得的部分HSP90基因序列為基礎,設計了特異性擴增引物,通過c DNA末端快速擴增(Rapid Amplification of c DNA Ends,RACE)技術獲得了HSP90的5'端和3'端,將5'端和3'端序列進行拼接,得到了2 443 bp的全長cDNA。將序列提交至Gen Bank數據庫,得到的入口號為KX899924。東海原甲藻HSP90基因的全長c DNA序列包括1個111 bp的5′-UTR,1個199 bp的3′-UTR并含有一個poly(A)尾巴,ORF的長度為2 133 bp。ORF編碼711個氨基酸,預測氨基酸的等電點為4.95,分子量為85.81 k Da。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,東海原甲藻HSP90屬于甲藻屬,并與Gen Bank中的Prorocentrum minimun(Accession No.ADP65795.1)和Prorocentrum micans(Accession No.AAR27546.1)的HSP90關系較近。熒光定量PCR結果表明:在溫度脅迫下,HSP90的相對表達量在10℃時達到最大,并與20℃相比有顯著差異(P0.05),在20℃以下時,HSP90的表達量隨著溫度升高而逐漸降低,在溫度高于20℃時,HSP90的表達量隨著溫度升高而升高;在氮脅迫下,氮濃度在88μM時HSP90的相對表達量最大,并與對照組(氮濃度為880μM)有顯著差異(P0.05);在磷脅迫下,磷濃度在3.6μM時HSP90的相對表達量最大,并與對照組(磷濃度為36.0μM)有顯著差異(P0.05),隨著氮或磷濃度的降低,HSP90的表達量都呈現先升高后降低的趨勢;在銅離子脅迫下,銅離子濃度在31.25μM時HSP90的相對表達量最大,并與對照組(銅離子濃度為0μM)有顯著差異(P0.05),HSP90的相對表達量在達到最大值10.81倍后又降低到最小值3.04倍。上述結果說明,溫度、營養(yǎng)鹽和重金屬等脅迫條件可以致使HSP90大量表達以對抗環(huán)境脅迫帶來的負面影響。視紫紅質的主要功能是捕獲光能并將其轉化為其他能量,該基因在原甲藻中研究甚少,其對不同光譜和光強的轉化機制尚未清楚。以前期獲得的部分視紫紅質基因序列為基礎,設計了特異性引物,通過RACE技術獲得了視紫紅質的5'端和3'端,將5'端和3'端序列進行拼接,得到了1 104 bp的全長c DNA。將該序列提交至Gen Bank數據庫,得到的入口號為KY399746。東海原甲藻視紫紅質基因c DNA序列包含1個106 bp的5′-UTR,1個221 bp的3′-UTR并含有一個poly(A)尾巴,ORF的長度為777 bp。ORF編碼259個氨基酸,預測氨基酸的等電點為5.83,分子量為28.79 k Da。系統(tǒng)進化發(fā)育分析發(fā)現,東海原甲藻的視紫紅質基因與Gen Bank中的Pseudo-nitzschia granii(Accession No.AJA37445.1)的視紫紅質基因基因在同一分支,親緣關系較近。熒光定量PCR結果顯示:在持續(xù)光照循環(huán)中,視紫紅質基因的表達量隨光照時間延長表現出先升高后降低的趨勢;在持續(xù)黑暗循環(huán)中,視紫紅質基因的表達量呈現逐漸降低的趨勢,且各組與對照組均有顯著差異(P0.05);在暗亮光照循環(huán)中,視紫紅質基因的表達量在黑暗條件下逐漸降低,恢復光照后表達量又急速上升;在紅光、藍光和綠光照射下,視紫紅質基因的表達量在綠色光照組表達量最高,且藍光、綠光均與白光(對照組)有顯著差異(P0.05);在磷脅迫下,視紫紅質的表達量隨著磷濃度降低而減少,當磷濃度低于7.2μM時,視紫紅質的表達量與對照組均有顯著差異(P0.05)。進一步通過構建視紫紅質基因的重組表達載體,制備視紫紅質蛋白重組表達菌株,并用其對該蛋白的光譜特性進行初步分析,發(fā)現視紫紅質蛋白在320 nm處有最大吸收峰。上述結果為了解東海原甲藻在環(huán)境脅迫下的適應機制提供了新見解,對研究其他甲藻的適應機制也有一定的借鑒意義。
【圖文】：

28圖 2-10 內參基因 GAPDH 引物的擴增曲線和標準曲線Fig. 2-10 The amplification plot and standard curve of GAPDH primers

29圖 2-11 HSP90 基因引物的擴增曲線和標準曲線Fig. 2-11 The amplification plot and standard curve of GAPDH prime溫度脅迫下 HSP90 基因表達脅迫下 HSP90 基因的相對表達量如圖 2-12 所示。其中，20 與對照組相比，，具有顯著差異（P < 0.05）的是 10 °C 、15 °C10 °C 時，HSP90 的表達量達到最大，是對照組的 7.6 倍；其次，在這兩個溫度條件下 HSP90 表達量接近，并為對照組的 5.1 在 25 °C 最低，為對照組的 2.8 倍，并且和對照組沒有顯著兩個極端的溫度條件 10 °C 和 30 °C 雖然沒有顯著差異（P > 脅迫下 HSP90 表達量比較多的兩組。溫度兩兩接近的兩組比
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

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本文編號：2569636