【摘要】：羊駝被毛品質(zhì)佳,耳部毛發(fā)主要以粗毛為主,生長周期長;背部以細(xì)毛為主,生長周期短。研究顯示EDA信號(hào)通路在皮膚發(fā)育及毛發(fā)生長過程中有一定的調(diào)控作用。為了研究EDA對羊駝毛發(fā)生長的影響,同時(shí)從MicroRNA水平探索let-7b與EDA的靶向關(guān)系以及l(fā)et-7b對EDA的調(diào)控關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)以青年雄性羊駝為研究對象,首先利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測EDA在羊駝耳部、背部皮膚的表達(dá)差異,免疫組織化學(xué)定位EDA蛋白在羊駝耳部、背部皮膚的表達(dá)位置,從而探索EDA對羊駝毛發(fā)生長調(diào)控的作用;其次構(gòu)建雙熒光報(bào)告載體,驗(yàn)證let-7b與EDA的靶向關(guān)系;最后使用let-7b真核過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染羊駝皮膚成纖維細(xì)胞,檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中EDA的表達(dá)水平,旨在探索let-7b對EDA的調(diào)控作用方式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：(1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)結(jié)果顯示EDA mRNA和蛋白水平在羊駝耳部皮膚相對表達(dá)量均顯著高于背部皮膚(P0.01);免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,EDA在羊駝皮膚毛囊的毛根鞘部位強(qiáng)陽性表達(dá),毛基質(zhì)弱陽性表達(dá)。數(shù)據(jù)分析得到耳部皮膚的平均光密度值高于背部皮膚,差異極顯著(P0.01)。(2)雙熒光素報(bào)告載體結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組熒光素表達(dá)量下降,表明let-7b與EDA具有明顯的靶向關(guān)系。(3)let-7b真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染羊駝皮膚成纖維細(xì)胞后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組中EDA mRNA表達(dá)量顯著下降(P0.01),蛋白表達(dá)量也下降(P0.05)。細(xì)胞免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：EDA在成纖維細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá),并且在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中陽性反應(yīng)比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中弱。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,EDA在羊駝耳部和背部皮膚毛發(fā)中差異表達(dá),推測EDA對羊駝毛發(fā)的生長起到了一定的作用;EDA是let-7b作用的靶基因,且let-7b可能通過轉(zhuǎn)錄阻遏下調(diào)EDA mRNA和蛋白的表達(dá)。
【圖文】：

３．２羊駝耳部和背部皮膚ＥＤＡ邋ｍＲＮＡ表達(dá)差異逡逑結(jié)果如圖１－２Ａ：烙解曲線為單峰，表明擴(kuò)增過程中無非特異擴(kuò)增。根據(jù)２ＡＡｎ法逡逑得知ＥＤＡ在羊駝耳部皮膚表達(dá)量是背部的２．４２５倍，差異極顯著（ＰＯ．Ｏｌ）（圖１－２Ｂ）。逡逑Ｍｅｌｔ邋Ｃｕｒｖｅ逡逑ｒ菌ｉ柋Ｆ：邋ＩＩ青逡逑ｉ邋佭＂—P逡逑ｓ邋k＇0邋二；４轉(zhuǎn)片吉＝逡逑？邐邐邋■邋ｉＸ逡逑＾邋＾邋－＇．．＇■■＇！邋＾—逡逑ｍ邋７０．０邋巧．０邋說．０邋的．０邋ｍ邋９５．０逡逑ｕｍ＼逡逑Ｔｃｔｎｐｅｆｆｌｔｕｒｅ（＊Ｃ）逡逑圖１－２ＡＥＤＡ及１８ＳｒＲＮＡ基因溶解曲線逡逑Ｆｉｇ．ｌ－２Ａ邋ＰＣＲ邋ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ邋ｃｕｒｖｅ邋ｆｏｒ邋ＥＤＡ邋ａｎｄ邋１８Ｓ邋ｒＲＮＡ邋ｇｅｎｅ逡逑－１２－逡逑

圖２－１邋ＥＤＡ蛋白在羊推耳部、背部皮膚中表達(dá)位置逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｌｏｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＥＤＡ邋ｐｒｏｔｅｉ打邋ｉｎ邋ａｌｐａｃａ邋ｅａｒ邋ａｎｄ邋ｂａｃｋ邋ｓｋｉｎ逡逑表２－１邋ＥＤＡ蛋白陽性反應(yīng)物的平均光密度值逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－１邋Ｄａ拉邋ｏｆ邋ＥＤＡ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｒｅａｃ化ｎｔ邋ｍｅａｎ邋ｄｅｎｓｉｔｙ逡逑平均光密度值逡逑（Ｍｅａｎ邋ｄｅｎｓｉｔｙ）逡逑耳部（ｅａｒ）邐０．２９３化０．０３６９ａ逡逑背部（ｂａｃｋ）邐０．１５０８±０．０１１２？逡逑
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S829.9

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本文編號(hào)：2564874