發(fā)布時間：2019-11-23 08:33

【摘要】：羊駝被毛品質佳,耳部毛發(fā)主要以粗毛為主,生長周期長;背部以細毛為主,生長周期短。研究顯示EDA信號通路在皮膚發(fā)育及毛發(fā)生長過程中有一定的調控作用。為了研究EDA對羊駝毛發(fā)生長的影響,同時從MicroRNA水平探索let-7b與EDA的靶向關系以及l(fā)et-7b對EDA的調控關系,本實驗以青年雄性羊駝為研究對象,首先利用實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術檢測EDA在羊駝耳部、背部皮膚的表達差異,免疫組織化學定位EDA蛋白在羊駝耳部、背部皮膚的表達位置,從而探索EDA對羊駝毛發(fā)生長調控的作用;其次構建雙熒光報告載體,驗證let-7b與EDA的靶向關系;最后使用let-7b真核過表達載體轉染羊駝皮膚成纖維細胞,檢測轉染后細胞中EDA的表達水平,旨在探索let-7b對EDA的調控作用方式。實驗結果如下：(1)實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術結果顯示EDA mRNA和蛋白水平在羊駝耳部皮膚相對表達量均顯著高于背部皮膚(P0.01);免疫組織化學結果顯示,EDA在羊駝皮膚毛囊的毛根鞘部位強陽性表達,毛基質弱陽性表達。數(shù)據(jù)分析得到耳部皮膚的平均光密度值高于背部皮膚,差異極顯著(P0.01)。(2)雙熒光素報告載體結果顯示實驗組熒光素表達量下降,表明let-7b與EDA具有明顯的靶向關系。(3)let-7b真核表達載體轉染羊駝皮膚成纖維細胞后,實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術結果顯示轉染組中EDA mRNA表達量顯著下降(P0.01),蛋白表達量也下降(P0.05)。細胞免疫組織化學結果顯示：EDA在成纖維細胞質中大量表達,并且在轉染的細胞中陽性反應比未轉染細胞中弱。以上實驗結果提示,EDA在羊駝耳部和背部皮膚毛發(fā)中差異表達,推測EDA對羊駝毛發(fā)的生長起到了一定的作用;EDA是let-7b作用的靶基因,且let-7b可能通過轉錄阻遏下調EDA mRNA和蛋白的表達。
【圖文】：

３．２羊駝耳部和背部皮膚ＥＤＡ邋ｍＲＮＡ表達差異逡逑結果如圖１－２Ａ：烙解曲線為單峰，表明擴增過程中無非特異擴增。根據(jù)２ＡＡｎ法逡逑得知ＥＤＡ在羊駝耳部皮膚表達量是背部的２．４２５倍，差異極顯著（ＰＯ．Ｏｌ）（圖１－２Ｂ）。逡逑Ｍｅｌｔ邋Ｃｕｒｖｅ逡逑ｒ菌ｉ柋Ｆ：邋ＩＩ青逡逑ｉ邋佭＂—P逡逑ｓ邋k＇0邋二；４轉片吉＝逡逑？邐邐邋■邋ｉＸ逡逑＾邋＾邋－＇．．＇■■＇！邋＾—逡逑ｍ邋７０．０邋巧．０邋說．０邋的．０邋ｍ邋９５．０逡逑ｕｍ＼逡逑Ｔｃｔｎｐｅｆｆｌｔｕｒｅ（＊Ｃ）逡逑圖１－２ＡＥＤＡ及１８ＳｒＲＮＡ基因溶解曲線逡逑Ｆｉｇ．ｌ－２Ａ邋ＰＣＲ邋ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ邋ｃｕｒｖｅ邋ｆｏｒ邋ＥＤＡ邋ａｎｄ邋１８Ｓ邋ｒＲＮＡ邋ｇｅｎｅ逡逑－１２－逡逑

圖２－１邋ＥＤＡ蛋白在羊推耳部、背部皮膚中表達位置逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｌｏｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＥＤＡ邋ｐｒｏｔｅｉ打邋ｉｎ邋ａｌｐａｃａ邋ｅａｒ邋ａｎｄ邋ｂａｃｋ邋ｓｋｉｎ逡逑表２－１邋ＥＤＡ蛋白陽性反應物的平均光密度值逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－１邋Ｄａ拉邋ｏｆ邋ＥＤＡ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｒｅａｃ化ｎｔ邋ｍｅａｎ邋ｄｅｎｓｉｔｙ逡逑平均光密度值逡逑（Ｍｅａｎ邋ｄｅｎｓｉｔｙ）逡逑耳部（ｅａｒ）邐０．２９３化０．０３６９ａ逡逑背部（ｂａｃｋ）邐０．１５０８±０．０１１２？逡逑
【學位授予單位】：山西農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S829.9

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