發(fā)布時間：2019-11-16 06:45

【摘要】：泛素化在植物生長和發(fā)育過程中起重要作用,E3泛素連接酶負(fù)責(zé)對靶蛋白特異性識別,其中U-box結(jié)構(gòu)的E3泛素連接酶具有調(diào)控植物生長發(fā)育和免疫反應(yīng)等功能,并在抗逆性方面發(fā)揮作用。目前,關(guān)于蒺藜苜蓿U-box家族基因的研究尚未見報道。本研究從蒺藜苜蓿中克隆得到U-box(MtPUB4)基因,該基因cDNA全長2448bp,編碼815個氨基酸,包括1個U-box結(jié)構(gòu)(C-X2-H-X7-C-X7-C-X2-C-H-X2-H)和5個ARM結(jié)構(gòu)域,屬于U-box/ARM類型E3泛素連接酶。構(gòu)建原核表達載體pET-MtPUB4,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)表明在大腸桿菌中表達了MtPUB4蛋白。熒光定量PCR分析表明MtPUB4基因在蒺藜苜�；ㄖ械谋磉_量最高,在根中表達量最低。MtPUB4基因受到NaCl、聚乙二醇、脫落酸誘導(dǎo),隨著誘導(dǎo)時間增加,表達量呈現(xiàn)出增長趨勢。這些結(jié)果表明,MtPUB4基因在蒺藜苜蓿生長發(fā)育和抗逆性中可能起到重要調(diào)節(jié)作用,但在低溫脅迫中表達量稍微下降,變化不明顯。本研究成功構(gòu)建了pBI121-MtPUB4植物表達載體,為進一步轉(zhuǎn)化擬南芥突變體Atpub4奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

度計檢測，Ａ２６０／Ａ２８０值為１．８７７；Ａ２６０／Ａ２３０值為２．０５４，圖１蒺藜苜蓿ＲＮＡ提取和ＭｔＰＵＢ４基因ＰＣＲ擴增Ｆｉｇ．１ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＵ－ｂｏｘＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｇａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａＡ：ＲＮＡ提�。遥危粒澹簦颍幔悖簦椋铮睿唬拢海停簦校眨拢椿虻模遥裕校茫覕U增產(chǎn)物（１～３）ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＭｔＰＵＢ４ｇｅｎｅｂｙＲＴ－ＰＣＲ（１－３）；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．說明ＲＮＡ質(zhì)量較好（圖１Ａ）。將提�。遥危练崔D(zhuǎn)錄合成ｃＤＮＡ第一鏈；以ｃＤＮＡ第一鏈為模板，以基因特異性引物進行ＰＣＲ擴增目的片段（圖１Ｂ），利用ＤＮＡＭＡＮ拼接后的全長ｃＤＮＡ為２４４８ｂｐ。將該基因命名為ＭｔＰＵＢ４，ＮＣＢＩ登錄號為ＸＰ＿０１３４６０３８８．１。２．２生物信息學(xué)分析２．２．１保守結(jié)構(gòu)域運用Ｅｘｐａｓｙ網(wǎng)站ＳＭＡＲＴ程序?qū)Γ停簦校眨拢椿蚓幋a的蛋白結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示ＭｔＰＵＢ４蛋白２１５～２７８位氨基酸具有Ｕ－ｂｏｘ／ＡＥＭ家族所具備的典型Ｕ－ｂｏｘ結(jié)構(gòu)，５１５～７６４位氨基酸具有典型的ＡＲＭ重復(fù)結(jié)構(gòu)，，該基因?qū)儆冢眨猓铮易宓囊粏T，其編碼的Ｕ－ｂｏｘ保守氨基酸序列為ＦＣ－ＣＰＬＳＬＥＬＭＴＤＰＶＩＶＡＳＧＱＴＹＥＲＡＦＩＫＮＷＩＤＬＧＬＴＶＣＰＫＴＨＱＴＬＡＨＴＮＬＩＰＮＹＴＶＫＡＬＩＡＮＷ。運用ＮＣ－ＢＩ保守域在線

ｒｅｌｉｓｔｅｄｂｅｌｏｗ；Ｂｌａｃｋｉｎｄｉｃａｔｅｓ１００％ｉｄｅｎｔｉｔｙ；Ｐｉｎｋｉｎｄｉｃａｔｅｓ７５％ｉｄｅｎｔｉｔｙ；Ｂｌｕｅｉｎｄｉｃａｔｅｓ５０％ｉｄｅｎｔｉｔｙ．圖３蒺藜苜蓿Ｕ－ｂｏｘＥ３泛素蛋白ＭｔＰＵＢ４進化樹分析Ｆｉｇ．３ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＵ－ｂｏｘＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｇａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅＭｔＰＵＢ４ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ菌體在誘導(dǎo)后出現(xiàn)特異性條帶，各個濃度對蛋白表達圖４ＭｔＰＵＢ４基因在蒺藜苜蓿不同組織中的相對表達量Ｆｉｇ．４ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｔＰＵＢ４ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ影響不明顯。該蛋白在９０ｋＤａ條帶處，與預(yù)期結(jié)果８８．３６ｋＤａ相符（圖６）。說明該蛋白在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)，可用于進一步蛋白表達研究。２．６植物表達載體構(gòu)建將植物表達載體ｐＢＩ１２１和克隆載體分別酶切，回收相應(yīng)片段純化連接、轉(zhuǎn)化、挑取單菌落、提取質(zhì)粒，構(gòu)建ＭｔＰＵＢ４基因植物表達載體。經(jīng)過ＢａｍＨＩ酶切鑒定，得到與預(yù)期大小一致的目的片段（圖７）。鑒定為陽性的質(zhì)粒送公司測序后拼接，與基因序列一致，說明成功構(gòu)建植物表達ｐＢＩ１２１－ＭｔＰＵＢ４。６８ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６）Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．７

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本文編號：2561714