【摘要】：泛素化在植物生長和發(fā)育過程中起重要作用,E3泛素連接酶負責對靶蛋白特異性識別,其中U-box結構的E3泛素連接酶具有調控植物生長發(fā)育和免疫反應等功能,并在抗逆性方面發(fā)揮作用。目前,關于蒺藜苜蓿U-box家族基因的研究尚未見報道。本研究從蒺藜苜蓿中克隆得到U-box(MtPUB4)基因,該基因cDNA全長2448bp,編碼815個氨基酸,包括1個U-box結構(C-X2-H-X7-C-X7-C-X2-C-H-X2-H)和5個ARM結構域,屬于U-box/ARM類型E3泛素連接酶。構建原核表達載體pET-MtPUB4,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)表明在大腸桿菌中表達了MtPUB4蛋白。熒光定量PCR分析表明MtPUB4基因在蒺藜苜�；ㄖ械谋磉_量最高,在根中表達量最低。MtPUB4基因受到NaCl、聚乙二醇、脫落酸誘導,隨著誘導時間增加,表達量呈現出增長趨勢。這些結果表明,MtPUB4基因在蒺藜苜蓿生長發(fā)育和抗逆性中可能起到重要調節(jié)作用,但在低溫脅迫中表達量稍微下降,變化不明顯。本研究成功構建了pBI121-MtPUB4植物表達載體,為進一步轉化擬南芥突變體Atpub4奠定了基礎。
【圖文】：

度計檢測，Ａ２６０／Ａ２８０值為１．８７７；Ａ２６０／Ａ２３０值為２．０５４，圖１蒺藜苜蓿ＲＮＡ提取和ＭｔＰＵＢ４基因ＰＣＲ擴增Ｆｉｇ．１ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＵ－ｂｏｘＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｇａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａＡ：ＲＮＡ提�。遥危粒澹簦颍幔悖簦椋铮�；Ｂ：ＭｔＰＵＢ４基因的ＲＴ－ＰＣＲ擴增產物（１～３）ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＭｔＰＵＢ４ｇｅｎｅｂｙＲＴ－ＰＣＲ（１－３）；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．說明ＲＮＡ質量較好（圖１Ａ）。將提�。遥危练崔D錄合成ｃＤＮＡ第一鏈；以ｃＤＮＡ第一鏈為模板，以基因特異性引物進行ＰＣＲ擴增目的片段（圖１Ｂ），利用ＤＮＡＭＡＮ拼接后的全長ｃＤＮＡ為２４４８ｂｐ。將該基因命名為ＭｔＰＵＢ４，ＮＣＢＩ登錄號為ＸＰ＿０１３４６０３８８．１。２．２生物信息學分析２．２．１保守結構域運用Ｅｘｐａｓｙ網站ＳＭＡＲＴ程序對ＭｔＰＵＢ４基因編碼的蛋白結構域分析，結果顯示ＭｔＰＵＢ４蛋白２１５～２７８位氨基酸具有Ｕ－ｂｏｘ／ＡＥＭ家族所具備的典型Ｕ－ｂｏｘ結構，５１５～７６４位氨基酸具有典型的ＡＲＭ重復結構，，該基因屬于Ｕ－ｂｏｘ家族的一員，其編碼的Ｕ－ｂｏｘ保守氨基酸序列為ＦＣ－ＣＰＬＳＬＥＬＭＴＤＰＶＩＶＡＳＧＱＴＹＥＲＡＦＩＫＮＷＩＤＬＧＬＴＶＣＰＫＴＨＱＴＬＡＨＴＮＬＩＰＮＹＴＶＫＡＬＩＡＮＷ。運用ＮＣ－ＢＩ保守域在線

ｒｅｌｉｓｔｅｄｂｅｌｏｗ；Ｂｌａｃｋｉｎｄｉｃａｔｅｓ１００％ｉｄｅｎｔｉｔｙ；Ｐｉｎｋｉｎｄｉｃａｔｅｓ７５％ｉｄｅｎｔｉｔｙ；Ｂｌｕｅｉｎｄｉｃａｔｅｓ５０％ｉｄｅｎｔｉｔｙ．圖３蒺藜苜蓿Ｕ－ｂｏｘＥ３泛素蛋白ＭｔＰＵＢ４進化樹分析Ｆｉｇ．３ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＵ－ｂｏｘＥ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｇａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅＭｔＰＵＢ４ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ菌體在誘導后出現特異性條帶，各個濃度對蛋白表達圖４ＭｔＰＵＢ４基因在蒺藜苜蓿不同組織中的相對表達量Ｆｉｇ．４ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｔＰＵＢ４ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ影響不明顯。該蛋白在９０ｋＤａ條帶處，與預期結果８８．３６ｋＤａ相符（圖６）。說明該蛋白在大腸桿菌中成功誘導，可用于進一步蛋白表達研究。２．６植物表達載體構建將植物表達載體ｐＢＩ１２１和克隆載體分別酶切，回收相應片段純化連接、轉化、挑取單菌落、提取質粒，構建ＭｔＰＵＢ４基因植物表達載體。經過ＢａｍＨＩ酶切鑒定，得到與預期大小一致的目的片段（圖７）。鑒定為陽性的質粒送公司測序后拼接，與基因序列一致，說明成功構建植物表達ｐＢＩ１２１－ＭｔＰＵＢ４。６８ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６）Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．７

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本文編號：2561714