【摘要】：研究背景基因治療是很有前景的生物療法之一,在心血管、重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID-X1)、帕金森氏病、Wiskott-Aldrich綜合征、癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病等領(lǐng)域中具有極為廣闊的應(yīng)用前景。非病毒載體具有免疫原性小、生產(chǎn)成本低和遞送基因大小不受限制等優(yōu)點,已成為基因治療遞送載體研發(fā)的熱點。但其也存在內(nèi)涵體逃逸及胞內(nèi)攜載基因釋放困難,轉(zhuǎn)染效率低等問題,因此,研究開發(fā)新型高效低毒的基因載體具有十分重要的意義。環(huán)糊精(Cyclodextrin)作為常用的醫(yī)藥用輔料,具有生物相容性好、易于功能化修飾等特性,因而具備成為優(yōu)良基因遞送載體的潛力。由于環(huán)糊精的引入可以降低其他基因載體的細胞毒性,使得其在基因載體系統(tǒng)的設(shè)計中受到極大的關(guān)注。環(huán)糊精衍生物可以直接作為基因遞送載體,也可作為連接臂或是修飾物用于其他基因遞送載體的構(gòu)建,還可通過準(zhǔn)聚輪烷或聚輪烷的形式用于基因遞送。雖然環(huán)糊精在基因遞送領(lǐng)域具有極為廣闊的應(yīng)用前景,但仍存在體循環(huán)稀釋穩(wěn)定性差、內(nèi)涵體逃逸能力弱和轉(zhuǎn)染效率低等亟待解決的問題。研究目的:本論文綜合考慮以上研究背景,分別選用β-環(huán)糊精和α-環(huán)糊精為起始原料,設(shè)計合成兩大類新型基因遞送載體。第一類是以β-環(huán)糊精為起始原料,引入親水的陽離子頭部和疏水尾部形成兩親性聚陽離子β-環(huán)糊精衍生物。并通過引入不同類型及不同數(shù)目的陽離子頭部,以期獲得具有良好生物相容性,可以與質(zhì)粒dna自聚集并形成穩(wěn)定復(fù)合物和高轉(zhuǎn)染效率的基因載體。第二類是以α-環(huán)糊精為起始原料,制備腙鍵封端的聚輪烷,再引入不同類型和不同數(shù)目的氨基基團形成具有酸敏特性的超分子聚輪烷基因載體,以期獲得生物相容性好,具有內(nèi)涵體酸敏刺激—響應(yīng)特性和稀釋穩(wěn)定性的高效基因遞送載體。實驗方法:1、以β-cd為起始原料,與4-甲基苯磺酰氯發(fā)生酯化反應(yīng),得到6-位單取代的β-cd-ots。β-cd-ots與乙二胺進一步發(fā)生取代反應(yīng)形成β-cd-eda。β-cd-eda與硬脂酸發(fā)生酰胺化反應(yīng),得到疏水尾部修飾的β-cd-eda-c18。通過控制反應(yīng)當(dāng)量,以羰基二咪唑橋聯(lián)引入不同數(shù)目的n,n二甲基乙二胺(dmeda)或pei600作為親水的氨基陽離子頭部,分別得到兩系列(dme系列和pei系列)6種兩親性聚陽離子β-環(huán)糊精衍生物。2、以α-cd為起始原料,與cooh-peg-cooh在水溶液中形成準(zhǔn)聚輪烷。利用二苯甲酮腙在卡特縮合劑bop,hobt,edipa作用下對準(zhǔn)聚輪烷進行封端反應(yīng)得到聚輪烷;通過羰基二咪唑橋聯(lián)并控制反應(yīng)當(dāng)量分別引入不同數(shù)目的dmeda或pei600作為陽離子頭部,得到兩系列(prdme系列和prpei系列)6種α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷。3、采用mtt實驗對兩類12種載體材料的細胞毒性進行評價;采用納米粒度分析儀對載體材料/dna復(fù)合物的粒徑和zeta電位進行表征;通過凝膠阻滯實驗觀察載體材料對質(zhì)粒dna的復(fù)合能力;利用熒光顯微鏡以及流式細胞儀,以pegfp基因(cmv啟動子調(diào)控的表達增強綠色熒光蛋白的質(zhì)粒)為報告基因,以hek293t細胞為篩選模型,以基因轉(zhuǎn)染的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”pei25000作為陽性對照,對合成的12種載體材料轉(zhuǎn)染活性進行了評價和篩選,并對優(yōu)選的載體材料在血清存在下的轉(zhuǎn)染活性進行了考察。4、利用納米粒度分析儀和透射電子顯微鏡觀察α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷prpei-2/dna復(fù)合物的酸敏特性;通過稀釋穩(wěn)定性實驗、溶血實驗對prpei-2/dna復(fù)合物的稀釋穩(wěn)定性和內(nèi)涵體逃逸能力進行評價;選用不同細胞內(nèi)吞途徑抑制劑觀測了prpei-2/dna復(fù)合物的入胞機制。結(jié)果與討論:一、兩親性聚陽離子β-環(huán)糊精衍生物1、經(jīng)核磁共振氫譜和紅外圖譜鑒定,所合成的兩系列6種兩親性聚陽離子β-環(huán)糊精衍生物dme-1/2/3和pei-1/2/3均為目標(biāo)產(chǎn)物�；衔飀me-1,dme-2和dme-3中,每個β-環(huán)糊精分子上dmeda分子平均接枝度分別為3.0,7.1和10.3個;化合物pei-1,pei-2和pei-3中,每個β-環(huán)糊精分子上pei600分子平均接枝度分別為1.9,3.2和4.6個。2、mtt實驗結(jié)果表明,連接有dmeda頭部的dme系列衍生物均顯示較低的細胞毒性,連接有pei600頭部的pei系列衍生物在高濃度時具有一定的毒性,而且隨著pei600接枝數(shù)目的增多,材料毒性增大,但其毒性仍低于pei25000。3、dme系列衍生物中,dme-2和dme-3與質(zhì)粒dna形成的復(fù)合物粒徑在1171~2828nm之間,而dme-1與質(zhì)粒dna形成的復(fù)合物粒徑在140~369nm之間。pei系列衍生物中,復(fù)合物的粒徑均在97~181nm之間。zeta電位測定的結(jié)果顯示,隨著n/p比的增加,兩系列衍生物與dna復(fù)合物的zeta電位均有所增加。4、凝膠阻滯實驗顯示,所有材料在重量比5:1時均可與質(zhì)粒dna復(fù)合完全,dme-3和pei-3在n/p=1:1即與dna復(fù)合完全。5、基因轉(zhuǎn)染活性測定結(jié)果顯示,dme系列衍生物中,dme-2和dme-3的轉(zhuǎn)染效率較差,與陰性對照裸dna相當(dāng)。dme-1在n:p=30:1和50:1時具有較高的轉(zhuǎn)染活性,雖然陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)不及陽性對照pei25000,但其平均熒光強度優(yōu)于pei25000。而pei系列衍生物pei-1/2/3均具有較高的轉(zhuǎn)染效率,其陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)和平均熒光強度均優(yōu)于裸dna。雖然pei-2與pei-3的陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)不及pei25000,但其平均熒光強度在所有n/p比均優(yōu)于pei25000。pei-1在n/p=30的情況下其陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)與陽性對照pei25000相當(dāng),pei-1的平均熒光強度在所有n/p比均優(yōu)于pei25000。pei-1陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)和平均熒光強度均不受血清的影響,而陽性對照pei25000的陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)和平均熒光強度在血清存在條件下明顯降低。pei-1/dna復(fù)合物入胞機制研究結(jié)果表明,pei-1與dna形成的復(fù)合物主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的途徑入胞。二、α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷1、經(jīng)核磁共振氫譜和紅外圖譜鑒定,所合成的兩系列6種α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷prdme-1/2/3和prpei-1/2/3均為目標(biāo)物。prdme系列超分子聚輪烷prdme-1,prdme-2和prdme-3中,每個α-環(huán)糊精分子上dmeda分子平均接枝度分別為1.7,6.3和10.0個;prpei系列超分子聚輪烷prpei-1,prpei-2和prpei-3中,每個α-環(huán)糊精分子上pei600分子平均接枝度分別為1.1,2.9和4.1個。2、mtt實驗結(jié)果顯示,與pei25000相比,6種α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷均顯示較低的細胞毒性。隨著聚輪烷接枝的氨基陽離子數(shù)目增多,細胞毒性略有增加,但其毒性遠低于pei25000。連接pei數(shù)目最多的聚輪烷prpei-3在高濃度100μg/ml時其細胞存活率為pei25000的1.6倍。3、prdme系列超分子聚輪烷中,prdme-1與質(zhì)粒dna形成的復(fù)合物粒徑在1973~3468nm之間,prdme-2與prdme-3與質(zhì)粒dna形成的復(fù)合物粒徑在92~232nm之間。而prpei系列的超分子聚輪烷prpei-1/2/3與質(zhì)粒dna形成的復(fù)合物粒徑在81~123nm之間。zeta電位測定結(jié)果顯示,隨著n/p比的增加兩系列復(fù)合物的zeta電位均有所增加。4、凝膠阻滯實驗結(jié)果顯示,所得聚輪烷均具有極好的dna負載能力,除了prdme-1在重量比為10:1與dna復(fù)合完全,其余均在重量比1:1時與質(zhì)粒dna復(fù)合完全。5、基因轉(zhuǎn)染活性測定結(jié)果顯示,帶有dmeda氨基基團的聚輪烷prdme-1/2/3轉(zhuǎn)染活性較差,與裸的質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染活性相當(dāng)。而帶有pei600基團的聚輪烷prpei-1/2/3均顯示較高的轉(zhuǎn)染活性,其陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)和平均熒光強度均優(yōu)于裸dna。在聚輪烷prpei-1/2/3中,具有適中氨基密度的prpei-2轉(zhuǎn)染活性最高,其陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)和平均熒光強度在相同n/p比的情況下均優(yōu)于其他兩種聚輪烷。雖然超分子聚輪烷prpei-1和prpei-3的陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)不及pei25000,但其平均熒光強度在重量比為30和50時與pei25000相當(dāng)。超分子聚輪烷prpei-2的陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)與陽性對照pei25000相當(dāng),其平均熒光強度在重量比30和50時分別是pei25000的1.4和1.3倍。prpei-2的陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)和平均熒光強度均不受血清存在的影響,而陽性對照pei25000的陽性轉(zhuǎn)染細胞數(shù)和平均熒光強度在血清存在條件下明顯降低。6、prpei-2/dna復(fù)合物酸敏實驗結(jié)果顯示,ph7.4孵育時,透射電鏡觀測到prpei-2/dna復(fù)合物為規(guī)則的球形納米粒,但在ph5.0孵育時,其粒徑和形態(tài)都發(fā)生了顯著的改變,粒徑從158nm(ph7.4)變?yōu)?55nm(ph5.0)且粒徑分布出現(xiàn)了多重峰,復(fù)合物形態(tài)松散且不規(guī)則。上述結(jié)果表明prpei-2/dna復(fù)合物具有酸敏刺激響應(yīng)特性,可以在血液循環(huán)和胞外環(huán)境中保持相對穩(wěn)定(ph7.4),但在酸性的內(nèi)涵體中(ph5.0)復(fù)合物結(jié)構(gòu)變得松散膨大,使得聚輪烷與dna之間的相互作用減弱,從而有利于dna從復(fù)合物中釋放。7、溶血實驗結(jié)果顯示,與ph7.4相比,超分子聚輪烷prpei-2/dna復(fù)合物在ph5.0時具有更強的膜破壞能力。進一步的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果表明,當(dāng)prpei-2/dna復(fù)合物與紅細胞在ph7.4孵育時,紅細胞形態(tài)完整,呈現(xiàn)雙面微凹之圓盤狀。當(dāng)其與紅細胞在ph5.0孵育時,紅細胞的細胞膜上出現(xiàn)了孔洞,細胞溶脹甚至破裂。上述結(jié)果表明超分子聚輪烷prpei-2是一個很有前景的基因載體材料,其酸敏-刺激響應(yīng)特性有利于基因載體復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸,大大提高其基因轉(zhuǎn)染效率。8、稀釋穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示,prpei-2可以與質(zhì)粒dna形成粒徑為160nm的納米粒,而且其粒徑及粒徑分布可以在稀釋至128倍時仍然保持穩(wěn)定。相反地,pei25000/dna形成的復(fù)合物在稀釋至16或32倍時,復(fù)合物納米粒粒徑變得不均一,出現(xiàn)解聚或形成團塊,其粒徑與稀釋前相比分別增加了1.5或2倍,且粒徑分布范圍變寬,pdi增加到0.37。這些結(jié)果表明超分子聚輪烷prpei-2與質(zhì)粒dna形成的復(fù)合物可以有效對抗進入體內(nèi)后的血液稀釋,具備優(yōu)良基因治療載體的特性。9、復(fù)合物入胞機制研究結(jié)果表明,當(dāng)加入網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞抑制劑氯丙嗪的濃度為15,20和30μm時,與不加抑制劑的對照組相比,轉(zhuǎn)染效率分別降低了45.7%,70.8%和99.4%;當(dāng)加入小窩蛋白抑制劑金雀異黃酮濃度為75μm時,復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率與對照組相當(dāng),當(dāng)濃度繼續(xù)增大到150和200μm時,與不加抑制劑的對照組相比,轉(zhuǎn)染效率分別降低了46.9%和49.7%;而當(dāng)加入巨胞飲抑制劑阿米洛利濃度高達200μm時,prpei-2/dna復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率依然保持不變。上述結(jié)果表明,prpei-2/dna復(fù)合物主要通過網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞,而網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞機制對其轉(zhuǎn)染效率影響更大。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞通常涉及網(wǎng)格蛋白的內(nèi)化并將內(nèi)吞物轉(zhuǎn)移至內(nèi)涵體和溶酶體降解,因此對于經(jīng)網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞作用進入細胞的基因載體來說,提高其內(nèi)涵體逃逸能力尤為重要。本文在超分子聚輪烷prpei-2中引入內(nèi)涵體酸性環(huán)境下刺激響應(yīng)的腙鍵,對提高prpei-2/dna的基因轉(zhuǎn)染活性具有重要的意義。結(jié)論:1、設(shè)計并合成了兩類12種基于環(huán)糊精的新型兩親性聚陽離子β-環(huán)糊精衍生物和α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷基因載體。核磁及紅外鑒定結(jié)果表明所得載體材料與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)一致。2、所構(gòu)建的12種載體材料均具有較低的毒性,兩類載體中α-環(huán)糊精酸敏超分子聚輪烷類具有更好的生物相容性。3、連接PEI600的載體材料其轉(zhuǎn)染活性均優(yōu)于連接DMEDA的載體材料,且氨基基團的數(shù)目會影響其轉(zhuǎn)染效率。其中PEI-1和PRPEI-2在同類載體材料中轉(zhuǎn)染活性最高,在含血清條件下依然能夠保持良好的轉(zhuǎn)染活性,且均優(yōu)于PEI25000。4、PEI-1與DNA形成的復(fù)合物主要通過小窩蛋白介導(dǎo)的途徑入胞,該途徑可以避免被溶酶體降解,有利于提高該類基因遞送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率;PRPEI-2載體系統(tǒng)具有良好的稀釋穩(wěn)定性和酸敏刺激-響應(yīng)特性,其主要入胞機制為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞,內(nèi)吞后PRPEI-2可在胞內(nèi)內(nèi)涵體酸敏刺激下發(fā)生內(nèi)涵體逃逸并能有效地釋放所負載的DNA,有望作為刺激-響應(yīng)的基因遞送載體進行進一步的研究。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文能與 PEG- -CDE/pDNA/CDs 準(zhǔn)聚輪烷肌肉注射后在體液中逐級稀釋有關(guān)。體液的稀釋引起環(huán)糊精從 PEG 鏈上脫落，pDNA 釋放。PEG- -CDE/p DNA 復(fù)合物內(nèi)吞進入細胞后，通過樹狀聚合物的質(zhì)子海綿效應(yīng)和 -CD 分子與內(nèi)涵體膜上脂質(zhì)的相互作用而從內(nèi)涵體逃逸[112]。

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文烷顯示出很強的質(zhì)粒 DNA 復(fù)合能力，凝聚成的納米顆粒粒徑在 100~400 nm 的范圍內(nèi)。所有陽離子聚輪烷/DNA 復(fù)合物都具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率。OEI 鏈長會影響聚輪烷的轉(zhuǎn)染效率（隨著 OEI 鏈長的增加），它們的轉(zhuǎn)染效率與支鏈 PEI25000 接近，但細胞毒性明顯低于支鏈 PEI25000，，這可能與超分子結(jié)構(gòu)聚輪烷具有較低的正電荷密度有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R450

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本文編號：2561600