【摘要】：rLj-RGD4是一個(gè)人工合成基因重組肽。本課題組以前期研究的rLj-RGD3為原型進(jìn)行了缺失突變體的基因設(shè)計(jì),并且通過在表達(dá)序列增加終止密碼子,以獲得無純化標(biāo)簽的rLj-RGD4肽表達(dá)。rLj-RGD4的原型rLj-RGD3是一個(gè)分子量為14.5 kDa的RGD毒素蛋白,其來源于海洋生物-七鰓鰻。rLj-RGD3含有3個(gè)RGD序列,具有強(qiáng)效抗腫瘤功能。由于rLj-RGD3分子量較大,在未來的生物制藥中存在潛在的免疫原性風(fēng)險(xiǎn),故本課題對(duì)其進(jìn)行了蛋白縮短改造,設(shè)計(jì)出Lj-RGD4基因。本課題人工合成的Lj-RGD4基因構(gòu)建于pET23b質(zhì)粒載體,對(duì)獲得的帶有陽性重組質(zhì)粒(pET23b-RGD4)的表達(dá)菌BL21進(jìn)行了終濃度為1 mM的IPTG重組表達(dá)。經(jīng)對(duì)表達(dá)時(shí)間和表達(dá)溫度的條件摸索,最后確認(rèn)rLj-RGD4在30℃條件下誘導(dǎo)12 h可溶性表達(dá)量最高。rLj-RGD4為自身帶有5個(gè)組氨酸殘基,故對(duì)無純化標(biāo)簽的rLj-RGD4仍可采用鎳柱進(jìn)行親和層析純化。rLj-RGD4肽分子量為6.27 kDa,含有4個(gè)RGD模體。純化蛋白經(jīng)N-端測(cè)序,結(jié)果證實(shí)表達(dá)序列和理論推導(dǎo)序列一致。為了研究無純化標(biāo)簽的rLj-RGD4肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能,本課題采用小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16作為研究模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本課題針對(duì)腫瘤的增長和轉(zhuǎn)移的幾個(gè)關(guān)鍵性步驟,對(duì)rLj-RGD4肽的功能進(jìn)行了測(cè)定。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法)表明,rLj-RGD4肽能夠劑量依賴性地抑制bFGF誘導(dǎo)的小鼠B16細(xì)胞的增殖,其作用的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)為9.6μM。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,rLj-RGD4以劑量依賴方式抑制B16細(xì)胞對(duì)纖粘連蛋白(fibronectin,FN)的黏附。Transwell法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),rLj-RGD4對(duì)堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)誘導(dǎo)的B16細(xì)胞遷移具有抑制作用,且呈劑量依賴方式。利用Transwell和人工基質(zhì)膜Matrigel模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境進(jìn)行的細(xì)胞浸潤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,rLj-RGD4對(duì)堿性成纖維生長因子誘導(dǎo)的B16細(xì)胞浸潤具有抑制作用且呈劑量依賴方式:小劑量4.8μM的rLj-RGD4對(duì)B16細(xì)胞浸潤的抑制率為31.7%,中劑量9.6μM的Lj-RGD4對(duì)B16細(xì)胞遷移的抑制率為72.3%,而高劑量14.4μM的Lj-RGD4對(duì)B16細(xì)胞遷移的抑制率達(dá)到100%。接下來,本課題對(duì)rLj-RGD4肽能否引起B(yǎng)16細(xì)胞發(fā)生凋亡進(jìn)行了測(cè)定。采用Hochest33258染色和TUNEL-FITC染色結(jié)果顯示,rLj-RGD4能顯著呈劑量依賴方式誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生凋亡,這表明了rLj-RGD4抑制B16細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)是凋亡而不是壞死;利用鬼筆環(huán)肽-FITC染色研究了rLj-RGD4對(duì)B16細(xì)胞骨架的影響。細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,rLj-RGD4蛋白能以劑量依賴方式破壞細(xì)胞骨架并抑制細(xì)胞偽足的形成。通過Western blot法進(jìn)一步研究rLj-RGD4作用于B16黑色素瘤細(xì)胞的機(jī)制,結(jié)果表明其能使Caspase-3酶原表達(dá)并裂解成17 kDa亞單位的水平增加、使B16細(xì)胞的抗凋亡基因BcL-2表達(dá)下調(diào)。綜上所述,rLj-RGD4能夠抑制腫瘤增長與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性步驟包括增殖、黏附、遷移、浸潤及細(xì)胞偽足的形成,并且能夠誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生凋亡。由于其rLj-RGD4是分子量只有6.27 kDa的小肽,其更加具有抗腫瘤藥物的應(yīng)用前景。未來隨著對(duì)rLj-RGD4研究的進(jìn)一步深入,有望為我國抗腫瘤藥物研發(fā)提供一類抗腫瘤候選新藥。
【圖文】：

人工合成基因重組肽 rLj-RGD4 對(duì)小鼠黑色素瘤 B16 細(xì)胞的抑制作用生密切相關(guān)。另外，肩突硬蜱中的 ISL929 和 ISL1373 及來自犬鉤細(xì)胞上的整合素 CD11b/CD18 的表達(dá)而影響白細(xì)胞的粘附和及素來源 RGD 肽的結(jié)構(gòu)特征及其所處微環(huán)境物毒素來源的去整合素(disintegrins)都是含有 RGD 模體的蛋白合素含有 KGD ( Lys-Gly-Asp)模體。去整合素大多含有豐富的此之外，在動(dòng)物體內(nèi)正常標(biāo)的許多胞外基質(zhì)蛋白都含有 RGD 模連蛋白（vitronectin , VN），纖連蛋白（fibrinogen, Fg），凝血管性血友病因子（vWF），骨橋蛋白等[35]，并且參與到細(xì)胞與[36]。一般具有環(huán)形和線形兩種結(jié)構(gòu)。由于線形結(jié)構(gòu)的 RGD 很不穩(wěn)定環(huán)形結(jié)構(gòu)的 RGD 肽。環(huán)形 RGD 肽與其受體的結(jié)合能力和特異

因此，利用αVβ3 的抑制劑則可能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從率[64]。-2 即人類表皮生長因子受體 2，它在許多癌細(xì)胞中都是過表達(dá)的。這用 HER-2 通路進(jìn)行生長和成瘤。因?yàn)棣?β1 與 HER-2 相互作用，因此可以下調(diào) HER-2 的表達(dá)，從而使癌細(xì)胞正�；�。而且，這種正�；环旨纯蒣66]。的，并不是所有的含有 RGD 的蛋白都能抑制腫瘤細(xì)胞的生長。Ba鈣粘蛋白 17(cadherin 17 ,CDH17)的第 6 結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了 1 個(gè) RGD 果 CDH17 過表達(dá)，將會(huì)促進(jìn)腫瘤的增殖和黏附；而將其中的 RGD能顯著抑制腫瘤生長進(jìn)程[67]。因此，通過突變?cè)?RGD 序列可能也，有的整合素能促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，如αVβ3；而有的則起抑制作用，如于細(xì)胞的來源不同，作用機(jī)制也不盡相同。另外，，不同作用的 RGD們，對(duì)不同的細(xì)胞系的致瘤機(jī)制應(yīng)該作深入的研究。這樣可能為我們者整合素以及不同的策略來治療癌癥。
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R91

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本文編號(hào)：2561455