發(fā)布時(shí)間：2019-11-10 00:27

【摘要】：成體干細(xì)胞(Adult Stem Cells,ASCs)是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。維持ASCs自我更新和分化之間的平衡對于組織器官的內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。研究表明,來自干細(xì)胞的內(nèi)源因子對這種平衡的維持是必不可少的。此外,ASCs周圍微環(huán)境(或稱“niche”)分泌的因子作為外源信號,也調(diào)節(jié)著這種平衡。生殖干細(xì)胞(Germline Stem Cells,GSCs)是ASCs的一種類型,它在配子發(fā)生及種族延續(xù)等眾多生命過程中扮演著重要的角色。果蠅(Drosophila melanogaster)作為一種經(jīng)典的模式生物,其卵巢為生殖干細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究提供了良好的模型。果蠅hsp83為哺乳動(dòng)物hsp90的同源基因,編碼一種熱休克蛋白Hsp83。研究表明,Hsp83蛋白主要作為分子伴侶發(fā)揮功能,調(diào)控眾多的生物學(xué)過程,如調(diào)控果蠅胸、眼、翅膀、剛毛等器官的形態(tài)發(fā)生,調(diào)節(jié)果蠅的卵子發(fā)生等。在前期的研究過程中,我們發(fā)現(xiàn):與對照組相比,hsp83基因突變體果蠅卵巢生殖干細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)了減少的表型。由此,我們設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),并借助免疫組化、果蠅轉(zhuǎn)基因及有絲分裂重組等技術(shù),揭示了hsp83基因調(diào)控果蠅GSC維持的初步機(jī)制。首先,利用免疫組織化學(xué)技術(shù)特異標(biāo)記GSCs,研究了三組hsp83突變類型(hsp8308445-/-、hsp8308445/hsp83e6d、hsp8308445/hsp83e6a)羽化后不同天數(shù)果蠅卵巢GSC的數(shù)量。結(jié)果顯示:野生型果蠅原卵區(qū)通常包含2-3個(gè)GSC。羽化后第1天,三組hsp83基因突變類型果蠅正常原卵區(qū)(含2-3個(gè)GSC)的比例分別為:98.77%、100%、80.43%;羽化后第21天,含有正常原卵區(qū)的比例分別下降為:76.90%、73.68%、34.23%。其中,hsp8308445/hsp83e6a一組突變體的表型最為嚴(yán)重,約有44%原卵區(qū)未檢測到GSC。其次,研究了內(nèi)、外源性敲低hsp83基因表達(dá)(RNA干擾)情況下,羽化后不同天數(shù)(1d、7d、14d)果蠅卵巢GSC的數(shù)量。結(jié)果顯示:在三個(gè)時(shí)間點(diǎn),對照組中正常原卵區(qū)的比例分別為98.36%、94.64%、92.31%,都處于正常水平。當(dāng)GSC中內(nèi)源性地敲低hsp83后,正常原卵區(qū)的比例分別下降為63.69%、53.56%、12.18%,特別是在第14天出現(xiàn)了嚴(yán)重降低。當(dāng)GSC微環(huán)境中外源性地敲低hsp83后,正常原卵區(qū)的比例分別為92.47%、80.49%、69.89%,也出現(xiàn)了輕微的下調(diào)。上述結(jié)果表明,隨著時(shí)間的推移,hsp83基因突變及表達(dá)下調(diào)均導(dǎo)致卵巢GSCs數(shù)量呈現(xiàn)為下降趨勢。為確證此結(jié)果,利用hsp83P-hsp83轉(zhuǎn)基因果蠅品系對突變體進(jìn)行了表型挽救試驗(yàn)。兩組突變類型(hsp8308445/hsp83e6d與hsp8308445/hsp83e6a)的挽救試驗(yàn)結(jié)果顯示:羽化后第21天正常原卵區(qū)的比例分別為90.79%、89.78%,恢復(fù)到正常水平。上述結(jié)果表明,hsp83基因影響果蠅卵巢生殖干細(xì)胞的維持。前期結(jié)果表明hsp83內(nèi)源性下調(diào)嚴(yán)重影響了GSC數(shù)量維持,為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果,利用嵌合體分析技術(shù)標(biāo)記hsp83基因突變的GSC,然后統(tǒng)計(jì)突變體GSC數(shù)量隨時(shí)間推移的變化情況。結(jié)果顯示:誘導(dǎo)后第2天,對照組標(biāo)記的生殖干細(xì)胞克隆的比例為51.04%;到誘導(dǎo)后第20天,對照組標(biāo)記的GSC克隆的比例變?yōu)?8.54%,僅有4.9%標(biāo)記的生殖干細(xì)胞丟失。而三組標(biāo)記的hsp83突變(hsp830844、hsp83e6d、hsp83e6a)的GSC克隆的比例在誘導(dǎo)后第2天分別為51.52%、47.37%和46.45%,到誘導(dǎo)后第20天分別下降到32.71%、24.29%和2.90%。與對照組相比,發(fā)生了顯著地降低。其中,實(shí)驗(yàn)組hsp83e6a中有93.8%標(biāo)記的GSC克隆發(fā)生了丟失。此結(jié)果表明:hsp83內(nèi)源性缺失會導(dǎo)致生殖干細(xì)胞的丟失。為了進(jìn)一步揭示hsp83基因是內(nèi)源性、還是外源性發(fā)揮調(diào)控作用,進(jìn)行了一系列的內(nèi)外源挽救實(shí)驗(yàn)。首先,采用內(nèi)源性挽救品系NosP-hsp83挽救hsp83突變體的表型。羽化后第21天的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:突變組hsp8308445/hsp83e6a正常原卵區(qū)比例為33.74%,挽救組正常原卵區(qū)的比例35.07%,二者無明顯差別。表明僅僅內(nèi)源性補(bǔ)充hsp83未能挽救GSC缺失表型。此外,采用UASP-hsp83轉(zhuǎn)基因品系與NosP-gal4工具株雜交的內(nèi)源性挽救實(shí)驗(yàn)也出現(xiàn)了相似的結(jié)果。其次,采用UASP-hsp83轉(zhuǎn)基因品系與c587-gal4工具株進(jìn)行了外源性挽救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示:羽化后第21天,挽救組正常原卵區(qū)的比例為21.43%,與hsp83突變組相比,無明顯差別。此結(jié)果表明僅僅外源性的補(bǔ)充hsp83也不能挽救hsp83突變的表型�？傊�,綜合內(nèi)、外源挽救實(shí)驗(yàn)及之前hsp83P-hsp83轉(zhuǎn)基因挽救實(shí)驗(yàn)兩方面的結(jié)果,充分暗示了hsp83同時(shí)發(fā)揮著內(nèi)源和外源性的調(diào)控作用,共同調(diào)控著GSC的命運(yùn)。為了揭示hsp83與BMP信號通路的關(guān)系,研究了hsp83與該信號交通路的兩個(gè)組分——Dad和bam的上下位關(guān)系。首先,利用免疫熒光染色技術(shù)研究了hsp83突變背景下Dad與bam的表達(dá)模式。結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組中Dad與bam的表達(dá)模式與對照組無明顯差異。該結(jié)果表明hsp83基因不是位于Dad及bam的上游發(fā)揮作用。其次,分析比較了bam突變、hsp83突變及hsp83bam雙突變條件下GSC的數(shù)量變化。結(jié)果顯示:在這四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(1d、7d、14d與21d),bam突變體卵巢原卵區(qū)中均充滿生殖干細(xì)胞樣細(xì)胞(tumor);hsp83突變體正常原卵區(qū)比例分別為75.00%、59.20%、47.46%、34.23%;雙突變體正常原卵區(qū)比例分別為75.81%、30.77%、20.45%、14.63%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hsp83bam雙突變體果蠅卵巢的表型與hsp83突變體的表型相似。上述結(jié)果表明了hsp83基因平行于“BMP-bam”信號通路而發(fā)揮功能。最后,采用TUNEL技術(shù)檢測了hsp83突變GSC的凋亡情況。結(jié)果顯示,與對照組相比,突變GSC未出現(xiàn)明顯的凋亡,暗示了hsp83突變促使GSC提前分化,從而導(dǎo)致GSC丟失。故我們推斷:在卵巢中過表達(dá)hsp83可能會延遲生殖干細(xì)胞和包囊母細(xì)胞(CB)的分化。為檢驗(yàn)這個(gè)推測,進(jìn)行了hsp83基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn),統(tǒng)計(jì)了果蠅卵巢原卵區(qū)中GSC和CB兩類細(xì)胞(“spectrosome”)的總數(shù)量。結(jié)果顯示:對照組中兩類細(xì)胞的平均數(shù)為3.75。(1)內(nèi)外源同時(shí)過表達(dá)的兩組果蠅(c587-gal4;UASP-hsp83;NosP-gvp和hsp83P-hsp83)原卵區(qū)中兩類細(xì)胞的平均數(shù)分別為4.55和4.29,數(shù)量略微增加。(2)內(nèi)源性過表達(dá)的三組(UASP-hsp83;Nos P-gvp、NosP-hsp83和NosP-gal4;UASP-hsp83)的平均數(shù)分別為4.01、3.97和3.85,與對照組無明顯差異。(3)外源性過表達(dá)的兩組(UASP-hsp83;Act-gal4、UASP-hsp83;Tub-gal4)的平均數(shù)分別為3.92與3.88,與對照組無明顯差別。上述結(jié)果表明過表達(dá)hsp83基因并不能有效的延遲GSC和CB細(xì)胞的分化,其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究�？傊�,研究結(jié)果表明:hsp83基因同時(shí)發(fā)揮著外源性和內(nèi)源性的調(diào)節(jié)作用,調(diào)控果蠅卵巢生殖干細(xì)胞的命運(yùn)。hsp83基因不依賴“BMP-bam”信號通路發(fā)揮功能,可能是通過一種新的機(jī)制調(diào)控生殖干細(xì)胞的命運(yùn)。
【圖文】：

圖 1-1 果蠅部分性狀Fig 1-1 characters of Drosophila的基本結(jié)構(gòu)一對卵巢，每個(gè)卵巢由 15-20 個(gè)卵巢管（ovarioles）是原卵區(qū)（germarium），原卵區(qū)中有三種干細(xì)胞：生cort Stem Cells, ESCs）和體干細(xì)胞（Somatic Stem C每個(gè)原卵區(qū)最頂部是由 8-10 個(gè)圓餅狀尾絲細(xì)胞（Te疊成的尾絲（Terminal Filament, TF），靠近尾絲的pCs），由 E-鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附固定在原卵區(qū)是 2-3 個(gè) GSCs，而和 GSCs 以及帽細(xì)胞直接接觸的干細(xì)胞組成 GSCs 的微環(huán)境，這個(gè)微環(huán)境又被稱為“分裂，分裂成兩個(gè)細(xì)胞，一個(gè)細(xì)胞靠近微環(huán)境，維持

4 其他信號通路果蠅發(fā)育過程中，Notch 信號通路調(diào)控一系列的生物學(xué)過程，如翅膀的發(fā)育子的發(fā)生，嗅覺可塑性的調(diào)控等[64; 65]。在果蠅卵巢中，Notch 信號通路還有一重要的作用，就是調(diào)控生殖干細(xì)胞的維持。主要是通過調(diào)控帽細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)決定微環(huán)境的大小，最終可能是通過BMP 信號通路決定生殖干細(xì)胞的命運(yùn)[66]調(diào)控果蠅生殖干細(xì)胞維持的還有 E 鈣黏蛋白（E-caderion）介導(dǎo)的細(xì)胞粘著鈣黏蛋白將生殖干細(xì)胞緊緊地錨定到帽細(xì)胞上，防止生殖干細(xì)胞向后轉(zhuǎn)移，使殖干細(xì)胞時(shí)刻處于微環(huán)境中，從而使 GSCs 得以維持[10]。Nos、Pum、Pelo 是 GSC 內(nèi)源的細(xì)胞因子，，它們也能調(diào)控果蠅卵巢生殖干細(xì)的命運(yùn)。它們調(diào)控生殖干細(xì)胞的維持也通過是一條不依賴 bam 的抑制分化的號通路。可能是細(xì)胞自主的調(diào)控生殖干細(xì)胞的命運(yùn)[61; 67; 68]。
【學(xué)位授予單位】：安徽師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q132.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄒彬鑌;石慶之;;HSP90抑制劑在急性髓細(xì)胞白血病治療中的最新研究進(jìn)展[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2014年02期

2 DánielKirilly;;The Drosophila ovary: an active stem cell community[J];Cell Research;2007年01期

本文編號：2558734