發(fā)布時間：2019-10-30 01:13

【摘要】：查爾酮合酶(CHS)是類黃酮生物合成過程中的第一個關(guān)鍵酶,其在類黃酮的合成過程中發(fā)揮著非常重要的作用。本研究以日本蛇根草為研究材料,根據(jù)其轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計(jì)全長引物,通過RT-PCR方法成功克隆得到日本蛇根草查爾酮合酶基因完整的cDNA序列,并利用相關(guān)生物信息學(xué)軟件對其進(jìn)行分析。結(jié)果表明,該基因序列全長為1 170 bp,編碼389個氨基酸,預(yù)測其蛋白分子量為42.783 kD,等電點(diǎn)為6.05,是親水性蛋白質(zhì),不含有信號肽,很可能定位在細(xì)胞質(zhì)中。同時,二級結(jié)構(gòu)分析顯示,日本蛇根草CHS的二級結(jié)構(gòu)分別由180個α螺旋、84個延伸鏈、125個無規(guī)則卷曲組成,這與三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致。日本蛇根草CHS基因的克隆對于研究植物類黃酮的生物合成及其分子機(jī)制具有重要意義,同時也豐富了雙子葉植物PKS基因家族的相關(guān)研究。
【圖文】：

蛇根草類黃酮代謝的研究仍處于空白階段。本研究以日本蛇根草為材料，利用分子生物學(xué)方法克隆得到其類黃酮合成的關(guān)鍵酶基因-CHS基因，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。該項(xiàng)工作將為未來研究茜草目植物CHS基因功能、及類黃酮代謝的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，同時對改良茜草目植物的類黃酮代謝研究具有重要指導(dǎo)意義。1結(jié)果與分析1.1CHS基因的克隆及其編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析以日本蛇根草的cDNA為模板，利用全長引物CHSF1，CHSR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的片段包含完整的CDS序列，長1170bp，編碼389個氨基酸(圖1)。隨后，利用ExPasy軟件對日本蛇根草查爾酮合酶的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測。結(jié)果顯示，CHS理論等電點(diǎn)為6.05，分子量為42.783kD，CHS基因的蛋白質(zhì)分子式為C1909H3058N512O564S18，蛋白質(zhì)的半衰期為30h，不穩(wěn)定指數(shù)是40.68，為不穩(wěn)定蛋白。CHS有49個負(fù)電荷氨基酸殘疾(Asp+Glu)，44個正電荷氨基酸殘疾(Arg+Lys)。其脂肪系數(shù)為93.24，平均疏水性為-0.094，表明該蛋白是一個親水蛋白質(zhì)。圖1日本蛇根草CHS基因的cDNA序列Figure1cDNAsequenceofOphiorrhizajaponicaCHSgene1260

定位的概率均低于細(xì)胞質(zhì)，分別是細(xì)胞核中21.7%、線粒體上13%、液泡中4.3%(表2)。因此，日本蛇根草的CHS蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中的可能性最大。1.5日本蛇根草CHS疏水性及編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測根據(jù)日本蛇根草CHS的氨基酸序列，利用Ex-Pasy軟件在線預(yù)測其疏水曲線，該蛋白的最高值為2.42，在第342個氨基酸處，，疏水性最強(qiáng)；最低值為-2.489，在第119個氨基酸處，親水性最強(qiáng)(圖4)。同時，從整條肽鏈的氨基酸預(yù)測值來看，其中大部分為負(fù)值，沒有明顯的疏水區(qū)域。由此可以推斷，日本蛇根草的CHS蛋白是一種親水性蛋白。圖2不同植物CHS蛋白氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure2PhylogenetictreeanalysisofCHSaminoacidsequenceindifferentplants移的短肽鏈，長度為5~30個氨基酸不等。它指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移，保證新合成的蛋白質(zhì)能夠準(zhǔn)確進(jìn)行定位運(yùn)輸。通過SignalP4.1Server在線軟件對日本蛇根草CHS所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行信號肽預(yù)測(表1)。當(dāng)相應(yīng)氨基酸殘基的平均信號肽得分值大于0.5時，被認(rèn)定存在信號肽；小于0.5時則不存在信號肽。而日本蛇根草查爾酮合成酶基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸殘基平均信號肽最大得分值為0.101，因此該蛋白不存在信號肽(圖3)。表1日本蛇根草CHS蛋白信號肽預(yù)測Table1SignalP-NNpredictionforOphiorrhizajaponicaCHSprotein指標(biāo)IndexMax.CMax.YMax.SMeanS位點(diǎn)Site301211-46分值Scores0.1100.1220.1590.101注:C-score:原始剪切位點(diǎn)的分值;S-score:信號肽的分值;Y-score:綜合剪切位點(diǎn)的分值Note:C-score:Scoresofputativecleavagesite;S-score:Scoresofsignalpeptide;Y-score:Scoresofsynthesiscleavagesite表2日本蛇根草CHS的亞細(xì)胞定位Table2SubcellularlocationofOph
【作者單位】： 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生理與發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;
【基金】：貴州師范大學(xué)資助博士科研項(xiàng)目(0516006) 貴州省聯(lián)合基金項(xiàng)目(黔科合LH字[2015]7777號) 貴州省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(黔科合計(jì)Z字[2011]4005)共同資助
【分類號】：Q943.2;S567.239

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本文編號：2553694