【摘要】：查爾酮合酶(CHS)是類黃酮生物合成過程中的第一個關(guān)鍵酶,其在類黃酮的合成過程中發(fā)揮著非常重要的作用。本研究以日本蛇根草為研究材料,根據(jù)其轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計全長引物,通過RT-PCR方法成功克隆得到日本蛇根草查爾酮合酶基因完整的cDNA序列,并利用相關(guān)生物信息學軟件對其進行分析。結(jié)果表明,該基因序列全長為1 170 bp,編碼389個氨基酸,預(yù)測其蛋白分子量為42.783 kD,等電點為6.05,是親水性蛋白質(zhì),不含有信號肽,很可能定位在細胞質(zhì)中。同時,二級結(jié)構(gòu)分析顯示,日本蛇根草CHS的二級結(jié)構(gòu)分別由180個α螺旋、84個延伸鏈、125個無規(guī)則卷曲組成,這與三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致。日本蛇根草CHS基因的克隆對于研究植物類黃酮的生物合成及其分子機制具有重要意義,同時也豐富了雙子葉植物PKS基因家族的相關(guān)研究。
【圖文】：

蛇根草類黃酮代謝的研究仍處于空白階段。本研究以日本蛇根草為材料，利用分子生物學方法克隆得到其類黃酮合成的關(guān)鍵酶基因-CHS基因，并對其進行了生物信息學分析。該項工作將為未來研究茜草目植物CHS基因功能、及類黃酮代謝的分子機制研究奠定基礎(chǔ)，同時對改良茜草目植物的類黃酮代謝研究具有重要指導意義。1結(jié)果與分析1.1CHS基因的克隆及其編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析以日本蛇根草的cDNA為模板，利用全長引物CHSF1，CHSR1進行PCR擴增。擴增得到的片段包含完整的CDS序列，長1170bp，編碼389個氨基酸(圖1)。隨后，利用ExPasy軟件對日本蛇根草查爾酮合酶的氨基酸序列進行理化性質(zhì)預(yù)測。結(jié)果顯示，CHS理論等電點為6.05，分子量為42.783kD，CHS基因的蛋白質(zhì)分子式為C1909H3058N512O564S18，蛋白質(zhì)的半衰期為30h，不穩(wěn)定指數(shù)是40.68，為不穩(wěn)定蛋白。CHS有49個負電荷氨基酸殘疾(Asp+Glu)，44個正電荷氨基酸殘疾(Arg+Lys)。其脂肪系數(shù)為93.24，平均疏水性為-0.094，表明該蛋白是一個親水蛋白質(zhì)。圖1日本蛇根草CHS基因的cDNA序列Figure1cDNAsequenceofOphiorrhizajaponicaCHSgene1260

定位的概率均低于細胞質(zhì)，分別是細胞核中21.7%、線粒體上13%、液泡中4.3%(表2)。因此，日本蛇根草的CHS蛋白定位在細胞質(zhì)中的可能性最大。1.5日本蛇根草CHS疏水性及編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測根據(jù)日本蛇根草CHS的氨基酸序列，利用Ex-Pasy軟件在線預(yù)測其疏水曲線，該蛋白的最高值為2.42，在第342個氨基酸處，，疏水性最強；最低值為-2.489，在第119個氨基酸處，親水性最強(圖4)。同時，從整條肽鏈的氨基酸預(yù)測值來看，其中大部分為負值，沒有明顯的疏水區(qū)域。由此可以推斷，日本蛇根草的CHS蛋白是一種親水性蛋白。圖2不同植物CHS蛋白氨基酸的系統(tǒng)進化樹分析Figure2PhylogenetictreeanalysisofCHSaminoacidsequenceindifferentplants移的短肽鏈，長度為5~30個氨基酸不等。它指導蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移，保證新合成的蛋白質(zhì)能夠準確進行定位運輸。通過SignalP4.1Server在線軟件對日本蛇根草CHS所編碼的蛋白質(zhì)進行信號肽預(yù)測(表1)。當相應(yīng)氨基酸殘基的平均信號肽得分值大于0.5時，被認定存在信號肽；小于0.5時則不存在信號肽。而日本蛇根草查爾酮合成酶基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸殘基平均信號肽最大得分值為0.101，因此該蛋白不存在信號肽(圖3)。表1日本蛇根草CHS蛋白信號肽預(yù)測Table1SignalP-NNpredictionforOphiorrhizajaponicaCHSprotein指標IndexMax.CMax.YMax.SMeanS位點Site301211-46分值Scores0.1100.1220.1590.101注:C-score:原始剪切位點的分值;S-score:信號肽的分值;Y-score:綜合剪切位點的分值Note:C-score:Scoresofputativecleavagesite;S-score:Scoresofsignalpeptide;Y-score:Scoresofsynthesiscleavagesite表2日本蛇根草CHS的亞細胞定位Table2SubcellularlocationofOph
【作者單位】： 貴州師范大學生命科學學院植物生理與發(fā)育調(diào)控重點實驗室;貴陽中醫(yī)學院藥學院;
【基金】：貴州師范大學資助博士科研項目(0516006) 貴州省聯(lián)合基金項目(黔科合LH字[2015]7777號) 貴州省重點實驗室建設(shè)項目(黔科合計Z字[2011]4005)共同資助
【分類號】：Q943.2;S567.239

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