【摘要】：以從黃牛瘤胃中分離到的一株具有將亞油酸轉(zhuǎn)化為c9,t11-共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)Fx為出發(fā)菌株,提取其基因組DNA,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增得到1 700 bp大小的亞油酸異構(gòu)酶(linoleic acid isomerase,LAI)基因片段,將該基因片段純化后進(jìn)行TA克隆,得到重組質(zhì)粒p UCm-T-LAI,將重組質(zhì)粒p UCm-T-LAI和表達(dá)質(zhì)粒p ET-Dsb A同時(shí)進(jìn)行雙酶切,連接得到重組表達(dá)載體p ET-Dsb A-LAI,經(jīng)PCR鑒定和酶切后,將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,得到具有LAI活性的重組菌株,能將亞油酸轉(zhuǎn)化為c9,t11-CLA,表明從Lactobacillus casei Fx成功克隆LAI,該研究將有助于深入了解不同瘤胃細(xì)菌特異性合成不同CLA異構(gòu)體的LAI基因差異。
【圖文】：

uscaseiFx中與c9,t11-CLA合成相關(guān)的LAI基因，以提取得到的該菌基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，得到一條大小約為1700bp的條帶，經(jīng)測(cè)序并與GenBank（CP002391.1）的序列進(jìn)行比對(duì)，兩者基因的同源性為98.0%，其編碼的氨基酸序列的同源性達(dá)到99.5%，由此可見(jiàn)LactobacilluscaseiFx中的LAI基因與文獻(xiàn)相一致。2.2LAI基因的克隆及鑒定將純化后的LAI基因與pUCm-T（2773bp）載體進(jìn)行連接反應(yīng)，提取pUCm-T-LAI克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切分析及PCR鑒定，進(jìn)一步判斷插入的片段是否為目的條帶，結(jié)果如圖2所示。泳道2得到約1700bp和2700bp左右的2個(gè)片段，與插入的LAI基因片段和質(zhì)粒pUCm-T大小一致。以提取的克隆質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，泳道1出現(xiàn)一條約為1700bp的條帶，與LAI基因相符。由此進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒是pUCm-T載體和LAI基因重組后的陽(yáng)性克隆子。4000bpM122000bp1000bpM.DNAMarker；1.PCR結(jié)果；2.雙酶切結(jié)果。圖2克隆質(zhì)粒的PCR鑒定及酶切鑒定Fig.2PCRidentificationoftherecombinantclonedplasmidafterenzymaticdigestion2.3LAI基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定4000bp2000bp1000bpM12M.DNAMarker；1.雙酶切結(jié)果；2.PCR結(jié)果。圖3重組表達(dá)載體的PCR鑒定及酶切鑒定Fig.3PCRidentificationoftherecombinantexpressionvectorafterenzymaticdigestion將pUCm-T-LAI克隆質(zhì)粒和pET-DsbA表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，經(jīng)連接反應(yīng)，得到重組表達(dá)載體pET-DsbA-LAI，對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定及酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示。用BamHⅠ、HindⅢ進(jìn)行雙酶切后，泳道1出現(xiàn)2個(gè)條帶，，大小分別約為3600bp和1700bp，分別符合pET-DsbA表達(dá)載體（3600bp）和LAI基因大校以提取的重組表達(dá)載體為模板，特異性PCR擴(kuò)增LAI基因，泳道2得到?

bp左右的2個(gè)片段，與插入的LAI基因片段和質(zhì)粒pUCm-T大小一致。以提取的克隆質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，泳道1出現(xiàn)一條約為1700bp的條帶，與LAI基因相符。由此進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒是pUCm-T載體和LAI基因重組后的陽(yáng)性克隆子。4000bpM122000bp1000bpM.DNAMarker；1.PCR結(jié)果；2.雙酶切結(jié)果。圖2克隆質(zhì)粒的PCR鑒定及酶切鑒定Fig.2PCRidentificationoftherecombinantclonedplasmidafterenzymaticdigestion2.3LAI基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定4000bp2000bp1000bpM12M.DNAMarker；1.雙酶切結(jié)果；2.PCR結(jié)果。圖3重組表達(dá)載體的PCR鑒定及酶切鑒定Fig.3PCRidentificationoftherecombinantexpressionvectorafterenzymaticdigestion將pUCm-T-LAI克隆質(zhì)粒和pET-DsbA表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，經(jīng)連接反應(yīng)，得到重組表達(dá)載體pET-DsbA-LAI，對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定及酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示。用BamHⅠ、HindⅢ進(jìn)行雙酶切后，泳道1出現(xiàn)2個(gè)條帶，大小分別約為3600bp和1700bp，分別符合pET-DsbA表達(dá)載體（3600bp）和LAI基因大校以提取的重組表達(dá)載體為模板，特異性PCR擴(kuò)增LAI基因，泳道2得到大小約為1700bp的單一條帶，與LAI基因大小相符，說(shuō)明得到的重組表達(dá)載體正確插入了目的條帶。表明本研究不僅成功構(gòu)建了pET-DsbA-LAI的重組載體，而且成功將其轉(zhuǎn)化到DH5α中。
【作者單位】： 南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(31260373) 江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(20161BBF60094)
【分類(lèi)號(hào)】：Q93;Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 莊海霽;雷虹;張鐵丹;周東坡;平文祥;;副干酪乳桿菌的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2006年06期

2 邵偉;熊澤;胡濱;;幾種保護(hù)劑對(duì)干酪乳桿菌代田株保護(hù)作用的比較[J];中國(guó)釀造;2006年12期

3 徐義剛;崔麗春;趙麗麗;唐麗杰;夏春麗;李一經(jīng);;重組干酪乳桿菌在模擬消化環(huán)境中生存性能的研究[J];中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志;2006年06期

4 王震;許麗娟;劉標(biāo);陳薇;賀月林;;培養(yǎng)條件對(duì)干酪乳桿菌生長(zhǎng)及降氨能力的影響[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年07期

5 卜永士,郭本恒;一株干酪乳桿菌的生物學(xué)特性研究[J];乳業(yè)科學(xué)與技術(shù);2004年02期

6 烏日娜;張和平;孟和;包秋華;陳霞;武俊瑞;;干酪乳桿菌蛋白質(zhì)雙向電泳條件優(yōu)化及圖譜建立[J];食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào);2009年05期

7 高微娟;張富新;魏怡;吳月紅;陳偉;;干酪乳桿菌對(duì)羊奶酸奶發(fā)酵特性及品質(zhì)的影響[J];陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年01期

8 王俊,周光宏,徐幸蓮,黃明;干酪乳桿菌蛋白酶純化與動(dòng)力學(xué)性質(zhì)[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2004年02期

9 譚君;侯喜林;余麗蕓;李劍華;王桂華;曹寧;;重組干酪乳桿菌代謝產(chǎn)物抑菌效果的研究[J];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào);2012年04期

10 周方方;吳正鈞;郭本恒;;干酪乳桿菌LC2W抗菌物質(zhì)的研究[J];乳業(yè)科學(xué)與技術(shù);2006年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前2條

1 王玉華;裴曉林;李巖;馮雁;;干酪乳桿菌的基因組改組及L-乳酸發(fā)酵工藝研究[A];中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)暨全國(guó)生物反應(yīng)器學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

2 王歡;高世偉;徐龍權(quán);劉瀅;張麗莉;趙蕭蕭;王際輝;;干酪乳桿菌固定化對(duì)共軛亞油酸生物合成的影響[A];中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)第五屆年會(huì)暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 記者 王科巖;干酪乳桿菌自主研發(fā)填國(guó)家空白[N];呼和浩特日?qǐng)?bào)(漢);2009年

2 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 曹瑞博　汪建明;干酪乳桿菌功能性研究[N];中國(guó)食品質(zhì)量報(bào);2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 鮑志寧;干酪乳桿菌GBHM-21鑒定、中試制備及發(fā)酵技術(shù)研究[D];華南理工大學(xué);2015年

2 陳正軍;干酪乳桿菌遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 邵玉宇;干酪乳桿菌和植物乳桿菌耐藥分子機(jī)制的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 吳重德;干酪乳桿菌抵御酸脅迫的生理機(jī)制解析[D];江南大學(xué);2012年

5 艾連中;干酪乳桿菌LC2W胞外多糖制備、功能及結(jié)構(gòu)的研究[D];江南大學(xué);2007年

6 郭春鋒;人源性益生菌降膽固醇機(jī)制及影響因素研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2011年

7 烏日娜;益生菌Lactobacillus casei Zhang蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鄒業(yè)霞;干酪乳桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建及異源蛋白的表達(dá)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 劉妍妍;體外評(píng)價(jià)副干酪乳桿菌NCU622的益生性能[D];南昌大學(xué);2015年

3 丁海梅;干酪乳桿菌在老白干香型白酒中的應(yīng)用[D];天津科技大學(xué);2013年

4 吳燕利;干酪乳桿菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵條件優(yōu)化及其制劑的功能評(píng)價(jià)[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

5 周濤;產(chǎn)胞外多糖干酪乳桿菌的篩選鑒定及galU基因克隆與分析[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 馬迎濤;微生態(tài)制劑副干酪乳桿菌素分離及理化特性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

7 郭志侯;表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌α-β_2-ε-β_1毒素的重組干酪乳桿菌的安全性評(píng)價(jià)及免疫效果的分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 齊宇;干酪乳桿菌對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌腸炎模型鼠Treg和Th17細(xì)胞分化的影響[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

9 伊淑帥;干酪乳桿菌部分生物學(xué)特性及其對(duì)肉雛雞生長(zhǎng)性能及主要免疫機(jī)能的影響[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

10 李陽(yáng);殼寡糖和干酪乳桿菌對(duì)肉雞肉品質(zhì)和脂肪代謝的影響及其作用機(jī)理[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

本文編號(hào)：2552826