【摘要】：以從黃牛瘤胃中分離到的一株具有將亞油酸轉(zhuǎn)化為c9,t11-共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)Fx為出發(fā)菌株,提取其基因組DNA,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增得到1 700 bp大小的亞油酸異構(gòu)酶(linoleic acid isomerase,LAI)基因片段,將該基因片段純化后進行TA克隆,得到重組質(zhì)粒p UCm-T-LAI,將重組質(zhì)粒p UCm-T-LAI和表達(dá)質(zhì)粒p ET-Dsb A同時進行雙酶切,連接得到重組表達(dá)載體p ET-Dsb A-LAI,經(jīng)PCR鑒定和酶切后,將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,得到具有LAI活性的重組菌株,能將亞油酸轉(zhuǎn)化為c9,t11-CLA,表明從Lactobacillus casei Fx成功克隆LAI,該研究將有助于深入了解不同瘤胃細(xì)菌特異性合成不同CLA異構(gòu)體的LAI基因差異。
【圖文】：

uscaseiFx中與c9,t11-CLA合成相關(guān)的LAI基因，以提取得到的該菌基因組為模板，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，得到一條大小約為1700bp的條帶，經(jīng)測序并與GenBank（CP002391.1）的序列進行比對，兩者基因的同源性為98.0%，其編碼的氨基酸序列的同源性達(dá)到99.5%，由此可見LactobacilluscaseiFx中的LAI基因與文獻相一致。2.2LAI基因的克隆及鑒定將純化后的LAI基因與pUCm-T（2773bp）載體進行連接反應(yīng)，提取pUCm-T-LAI克隆質(zhì)粒進行雙酶切分析及PCR鑒定，進一步判斷插入的片段是否為目的條帶，結(jié)果如圖2所示。泳道2得到約1700bp和2700bp左右的2個片段，與插入的LAI基因片段和質(zhì)粒pUCm-T大小一致。以提取的克隆質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，泳道1出現(xiàn)一條約為1700bp的條帶，與LAI基因相符。由此進一步證明重組質(zhì)粒是pUCm-T載體和LAI基因重組后的陽性克隆子。4000bpM122000bp1000bpM.DNAMarker；1.PCR結(jié)果；2.雙酶切結(jié)果。圖2克隆質(zhì)粒的PCR鑒定及酶切鑒定Fig.2PCRidentificationoftherecombinantclonedplasmidafterenzymaticdigestion2.3LAI基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定4000bp2000bp1000bpM12M.DNAMarker；1.雙酶切結(jié)果；2.PCR結(jié)果。圖3重組表達(dá)載體的PCR鑒定及酶切鑒定Fig.3PCRidentificationoftherecombinantexpressionvectorafterenzymaticdigestion將pUCm-T-LAI克隆質(zhì)粒和pET-DsbA表達(dá)載體進行雙酶切，經(jīng)連接反應(yīng)，得到重組表達(dá)載體pET-DsbA-LAI，對其進行PCR鑒定及酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示。用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切后，泳道1出現(xiàn)2個條帶，，大小分別約為3600bp和1700bp，分別符合pET-DsbA表達(dá)載體（3600bp）和LAI基因大校以提取的重組表達(dá)載體為模板，特異性PCR擴增LAI基因，泳道2得到?

bp左右的2個片段，與插入的LAI基因片段和質(zhì)粒pUCm-T大小一致。以提取的克隆質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，泳道1出現(xiàn)一條約為1700bp的條帶，與LAI基因相符。由此進一步證明重組質(zhì)粒是pUCm-T載體和LAI基因重組后的陽性克隆子。4000bpM122000bp1000bpM.DNAMarker；1.PCR結(jié)果；2.雙酶切結(jié)果。圖2克隆質(zhì)粒的PCR鑒定及酶切鑒定Fig.2PCRidentificationoftherecombinantclonedplasmidafterenzymaticdigestion2.3LAI基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定4000bp2000bp1000bpM12M.DNAMarker；1.雙酶切結(jié)果；2.PCR結(jié)果。圖3重組表達(dá)載體的PCR鑒定及酶切鑒定Fig.3PCRidentificationoftherecombinantexpressionvectorafterenzymaticdigestion將pUCm-T-LAI克隆質(zhì)粒和pET-DsbA表達(dá)載體進行雙酶切，經(jīng)連接反應(yīng)，得到重組表達(dá)載體pET-DsbA-LAI，對其進行PCR鑒定及酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示。用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切后，泳道1出現(xiàn)2個條帶，大小分別約為3600bp和1700bp，分別符合pET-DsbA表達(dá)載體（3600bp）和LAI基因大校以提取的重組表達(dá)載體為模板，特異性PCR擴增LAI基因，泳道2得到大小約為1700bp的單一條帶，與LAI基因大小相符，說明得到的重組表達(dá)載體正確插入了目的條帶。表明本研究不僅成功構(gòu)建了pET-DsbA-LAI的重組載體，而且成功將其轉(zhuǎn)化到DH5α中。
【作者單位】： 南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目(31260373) 江西省重點研發(fā)計劃項目(20161BBF60094)
【分類號】：Q93;Q78

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