【摘要】：木糖醇是一種五碳糖醇,具有抗齲齒、代謝不依賴胰島素、改善肝功能等特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)。當(dāng)前工業(yè)上生產(chǎn)木糖醇主要是利用半纖維素水解液中分離純化獲得的純木糖,在高溫高壓條件下使用鎳催化加氫制得,這種工藝條件苛刻、容易造成污染、生產(chǎn)成本較高。生物法生產(chǎn)木糖醇不需要高溫高壓條件、污染環(huán)境的鎳和高純度木糖等,所以生物法生產(chǎn)木糖醇越來越受到人們的重視。大腸桿菌作為生產(chǎn)各種高附加值化學(xué)品的理想宿主,其具有培養(yǎng)條件簡單、能夠利用半纖維素水解液中所有糖類、生長速度快、基因操作簡便、蛋白表達(dá)水平高等諸多優(yōu)點(diǎn)。目前,以大腸桿菌為宿主利用半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇的研究已有報(bào)道,但其生產(chǎn)效率低且成本較高,和化學(xué)法相比還不具備優(yōu)勢(shì)。本論文以大腸桿菌W3110為宿主細(xì)胞,針對(duì)目前基因工程菌生產(chǎn)木糖醇存在的問題,主要圍繞以下四個(gè)方面進(jìn)行了研究：1)在較高溫度下蛋白的高效可溶表達(dá)；2)目的基因在宿主菌中遺傳穩(wěn)定性；3)生產(chǎn)過程中副產(chǎn)物阿拉伯糖醇的消除；4)工業(yè)應(yīng)用中培養(yǎng)基的廉價(jià)化。首先,為了解決在較高溫度下蛋白可溶表達(dá)問題,我們基于質(zhì)粒載體系統(tǒng)構(gòu)建了第一代高產(chǎn)木糖醇菌株。利用質(zhì)粒載體進(jìn)行蛋白的表達(dá),通過mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié),構(gòu)建了一個(gè)能在較高溫度下高效可溶表達(dá)的質(zhì)粒；在30℃條件下,酶活是出發(fā)菌株的5.68倍。通過敲除葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中酶Ⅱ組分的ptsG基因,消除菌株的代謝物阻遏效應(yīng),使菌株能同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖和木糖；敲除菌株自身代謝木糖的基因xylA和xylB,阻斷木糖的代謝利用；敲除可轉(zhuǎn)運(yùn)木糖醇的果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中酶Ⅱ組分的ptsF基因,減少木糖醇的磷酸化；通過一系列的優(yōu)化,木糖醇生產(chǎn)效率是出發(fā)菌株的8.71倍。在實(shí)驗(yàn)室小試中,工程菌利用純木糖進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵,產(chǎn)生了172.4 g L-1的木糖醇,生產(chǎn)效率為1.57 g L-1h-1,相對(duì)于葡萄糖的摩爾得率達(dá)到2.2；利用半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇時(shí),產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)效率分別達(dá)到150gL-1和1.40 gL-1h-1。接著,為了解決使用質(zhì)粒系統(tǒng)帶來的菌株遺傳不穩(wěn)定的問題,我們建立了一套基因組多拷貝整合系統(tǒng)RecA-assisted chromosomal integration (RACI),使xr基因以特定拷貝數(shù)整合進(jìn)大腸桿菌的基因組；整個(gè)整合系統(tǒng)的核心是構(gòu)建一個(gè)含有IS5序列、R6K復(fù)制子、P43啟動(dòng)子和xr基因的載體；利用IS5序列作為整合位點(diǎn)進(jìn)行大腸桿菌基因組多拷貝整合,目的基因能在菌株內(nèi)穩(wěn)定遺傳。利用該系統(tǒng),我們構(gòu)建了一株基因組中存在4個(gè)拷貝xr的菌株。工程菌利用純木糖進(jìn)行分批發(fā)酵時(shí),產(chǎn)生了110.1 g L-1木糖醇,生產(chǎn)效率為3.06 g L-1h-1,此生產(chǎn)效率和使用多拷貝質(zhì)粒菌株的生產(chǎn)效率大致相當(dāng),但其優(yōu)點(diǎn)是不需要額外添加抗生素和誘導(dǎo)劑,降低了生產(chǎn)成本。進(jìn)一步,為了解決木糖醇生產(chǎn)過程中副產(chǎn)物阿拉伯糖醇的問題,我們對(duì)木糖還原酶進(jìn)行了定點(diǎn)突變,提高其對(duì)木糖的選擇性,獲得了一個(gè)對(duì)阿拉伯糖活性降低了27倍的突變體。在搖瓶發(fā)酵中,含有此突變體的菌株在使用質(zhì)粒作為表達(dá)載體時(shí),在產(chǎn)物中已檢測(cè)不到阿拉伯糖醇的存在；但在發(fā)酵罐發(fā)酵中仍有47.34%的阿拉伯糖轉(zhuǎn)化成阿拉伯糖醇。我們發(fā)現(xiàn)使用整合型菌株(木糖還原酶酶活較低),可以顯著降低阿拉伯糖醇的產(chǎn)生,只有9.6%的阿拉伯糖轉(zhuǎn)化成阿拉伯糖醇。使用含有突變酶的整合型菌株在發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇時(shí),在產(chǎn)物中已檢測(cè)不到阿拉伯糖醇。最后,為了使本工藝實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,獲得符合產(chǎn)業(yè)化需要的培養(yǎng)基組成,我們選擇工業(yè)級(jí)玉米漿干粉作為氮源,工業(yè)級(jí)葡萄糖作為碳源,半纖維素水解液作為底物,對(duì)生產(chǎn)條件進(jìn)行了優(yōu)化�？疾炝藴囟葘�(duì)酶活和木糖醇生產(chǎn)效率的影響,確定了菌株在30℃條件下,木糖醇的生產(chǎn)效率最高；經(jīng)過搖瓶水平的發(fā)酵條件優(yōu)化,確定了最佳底物濃度為20g L-1,最佳底物添加時(shí)機(jī)為菌株培養(yǎng)4小時(shí)后添加。進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí),工程菌產(chǎn)生了143.8 gL-1的木糖醇,生產(chǎn)效率為1.84gL-1h-1�？傊�,通過本論文的系統(tǒng)研究,實(shí)現(xiàn)了重組大腸桿菌利用廉價(jià)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化半纖維素水解液生產(chǎn)高純度木糖醇,為木糖醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【圖文】：

有待更深入的研究。逡逑雖然大部分微生物的ＣＣ民效應(yīng)的機(jī)制還是未知的，但作為模式微生物，大逡逑腸巧菌和妝覃芽泡桿菌，特別是大腸桿菌有過廣泛的研究（圖１．４），相比較于逡逑其它微生物，大腸桿菌是利用生物質(zhì)資源生產(chǎn)化學(xué)品的最理想菌株，因?yàn)槠淇桑蹋劐义侠蒙镔|(zhì)資源中的所有糖類、基因操作簡單、生長速度快、易于培養(yǎng)。在大腸逡逑桿菌中葡荀糖、木糖和阿拉伯糖分別通過褲酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（ＰＴＳ）、Ｘｙｌｔ（ＸｙｌＦＧＨ，逡逑ＸｙｌＥ）和Ａｒａｔ（ＡｒａＦＧＨ，ＡｒａＥ）進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。負(fù)責(zé)木糖和阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝的基逡逑因的轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄激活因子ＸｙｌＲ和ＡｒａＣ，并且它們的功能需要相關(guān)糖類激活；逡逑轉(zhuǎn)錄激活園子與相應(yīng)糖類結(jié)合后會(huì)與其后動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。逡逑非ＰＴＳ系統(tǒng)糖類的轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)受到菊萄糖ＰＴＳ系統(tǒng)的抑制，轉(zhuǎn)錄激活因子缺失誘導(dǎo)逡逑劑，導(dǎo)致相應(yīng)代謝基因不能夠后動(dòng)轉(zhuǎn)錄口８，５９］；這是由于在荀萄糖存在時(shí)，去蝶暖逡逑化的ＥＩＩＡＧＩ。水平升高

在解決了同時(shí)利用混合糖的問題么后，如何提高木糖的利用與木糖醇的生產(chǎn)逡逑效率化有過大量的巧究工作。由于木糖的還原是木糖醇生產(chǎn)的唯一步驟，木糖還逡逑原酶在木糖醇的生物合成中就顯得尤為重要了（如圖１．５）。目前，有多種木糖逡逑還原醇被發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)行了克隆和異源表這，但大多數(shù)酶的催化活性并不高，所Ｗ逡逑尋找催化活性更高的酶或者通過定向進(jìn)化提高木糖還原酶的澊活，對(duì)于提高木糖逡逑醇的生產(chǎn)效率是一個(gè)有效手段ＰＷ。由于木糖還原酶絕大部分都是從真核徵生物逡逑中發(fā)現(xiàn)的，在進(jìn)行異源表運(yùn)時(shí)經(jīng)過密碼子優(yōu)化可Ｗ提高菌株的活性和木糖醇的產(chǎn)逡逑量［４２］。另一方面，由于絕大多數(shù)木糖還原酶選擇性不高，對(duì)多種己糖和戍糖都有逡逑催化活性，，特別是阿拉伯糖，其是木糖的同分異構(gòu)體，是半纖維素水解液中僅次逡逑于未糖的單糖；其可ＬN(yùn)B被木糖還原酶催化還原成副產(chǎn)物阿拉伯糖醇。半纖維素水逡逑解液中阿拉伯糖的去除和產(chǎn)物中阿拉伯糖醇的分離是非常困難的，必然會(huì)導(dǎo)致較逡逑高的生產(chǎn)成本。為了提高木糖還原酶的選擇性，通過定向進(jìn)化獲得了一個(gè)木糖還逡逑原酶突變體
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TQ353

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本文編號(hào)：2548135