【摘要】：干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3(interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)在機(jī)體抗病毒和抗炎等方面發(fā)揮重要作用。為深入研究山羊IFITM3在病毒感染中的分子作用機(jī)制,對獲得的海南黑山羊IFITM3基因進(jìn)行了序列分析并采用RT-qPCR方法進(jìn)行了其組織特異性表達(dá)的檢測,利用原核表達(dá)的IFITM3蛋白制備了多克隆抗體,并進(jìn)行IFITM3在黑山羊組織中分布的研究。結(jié)果顯示,該基因表現(xiàn)出種屬內(nèi)保守性和種屬間差異性,編碼蛋白由147個(gè)氨基酸組成,存在2個(gè)潛在跨膜區(qū),不含信號(hào)肽。成功構(gòu)建pET-32a(+)-IFITM3表達(dá)載體并表達(dá)了35 ku重組蛋白,免疫家兔后,經(jīng)ELISA和Western-blot檢測,獲得的多克隆抗體特異性好。組織特異性表達(dá)的檢測結(jié)果表明,IFITM3在心臟表達(dá)水平最高,大腦和胸腺表達(dá)量最低。IFITM3在心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、肺支氣管上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、大腦皮質(zhì)、胸腺髓質(zhì)、腸系膜淋巴結(jié)皮質(zhì)淋巴細(xì)胞、胃底腺細(xì)胞和腸腺細(xì)胞中均有分布。研究結(jié)果為深入探討IFITM3在山羊疾病中的分子作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【圖文】：

中國獸醫(yī)科學(xué)第47卷圖3pET-32a（＋）-IFITM3的誘導(dǎo)和純化蛋白的SDS-PAGE及Western-blot分析Fig.3AnalysisoftherecombinantproteinbySDS-PAGEandWestern-blotM：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：誘導(dǎo)的pET-32a（＋）-IFITM3菌體；2：未誘導(dǎo)的pET-32a（＋）-IFITM3菌體；3：誘導(dǎo)的pET-32a（＋）空載菌體；4：未誘導(dǎo)的pET-32a（＋）空載菌體；5：純化的融合蛋白；6：His標(biāo)簽抗體檢測純化的融合蛋白；7：血清檢測融合蛋白M：ProteinmolecularweightMarker；1：LysateofpET-32a（＋）-IFITM3inducted；2：LysateofpET-32a（＋）-IFITM3withoutinducted；3：LysateofpET-32a（＋）inducted；4：LysateofpET-32a（＋）withoutinducted；5：Purifiedfusionprotein；6：Analysisofthepurifiedfusionproteinbyanti-Hisantibody；7：Analysisofthepurifiedfusionproteinbyanti-IFITM3serumantibody圖1海南黑山羊IFITM3基因的克隆及pET-32a（＋）-I-FITM3質(zhì)粒的鑒定Fig.1CloningofIFITM3geneofHainanblackgoatandi-dentificationofpET-32a（＋）-IFITM3M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：IFITM3的RT-PCR產(chǎn)物；2：pET-32a（＋）-IFITM3的雙酶切（EcoRⅠ和XhoⅠ）產(chǎn)物M：DL5000DNAMarker；1：RT-PCRproduct；2：ProductsfrompET-32a（＋）-IFITM3digestedwithEcoRⅠandXhoⅠ圖2IFITM3基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2PhylogenetictreebasedonIFITM3gene魚和非洲爪蟾等七種物種的IFITM3基因序列進(jìn)行的同源性分析表明，海南黑山羊IFITM3基因與牛的同源性最高，達(dá)95％；與斑馬魚的同源性最低，為48.5％。IFITM3基因的進(jìn)化樹分析表明，海南黑山羊IFITM3基因與牛的進(jìn)化距離最近，與禽類、兩棲類和魚類相距較遠(yuǎn)（見圖2）。運(yùn)用ProtParam對海南黑山羊IFITM3蛋白分析表明，此基因編碼147個(gè)氨?

3菌體；3：誘導(dǎo)的pET-32a（＋）空載菌體；4：未誘導(dǎo)的pET-32a（＋）空載菌體；5：純化的融合蛋白；6：His標(biāo)簽抗體檢測純化的融合蛋白；7：血清檢測融合蛋白M：ProteinmolecularweightMarker；1：LysateofpET-32a（＋）-IFITM3inducted；2：LysateofpET-32a（＋）-IFITM3withoutinducted；3：LysateofpET-32a（＋）inducted；4：LysateofpET-32a（＋）withoutinducted；5：Purifiedfusionprotein；6：Analysisofthepurifiedfusionproteinbyanti-Hisantibody；7：Analysisofthepurifiedfusionproteinbyanti-IFITM3serumantibody圖1海南黑山羊IFITM3基因的克隆及pET-32a（＋）-I-FITM3質(zhì)粒的鑒定Fig.1CloningofIFITM3geneofHainanblackgoatandi-dentificationofpET-32a（＋）-IFITM3M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：IFITM3的RT-PCR產(chǎn)物；2：pET-32a（＋）-IFITM3的雙酶切（EcoRⅠ和XhoⅠ）產(chǎn)物M：DL5000DNAMarker；1：RT-PCRproduct；2：ProductsfrompET-32a（＋）-IFITM3digestedwithEcoRⅠandXhoⅠ圖2IFITM3基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2PhylogenetictreebasedonIFITM3gene魚和非洲爪蟾等七種物種的IFITM3基因序列進(jìn)行的同源性分析表明，海南黑山羊IFITM3基因與牛的同源性最高，達(dá)95％；與斑馬魚的同源性最低，為48.5％。IFITM3基因的進(jìn)化樹分析表明，海南黑山羊IFITM3基因與牛的進(jìn)化距離最近，與禽類、兩棲類和魚類相距較遠(yuǎn)（見圖2）。運(yùn)用ProtParam對海南黑山羊IFITM3蛋白分析表明，此基因編碼147個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為15ku，等電點(diǎn)為6.49；TMpred預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白有2個(gè)潛在跨膜區(qū)，分別位于58～80位氨基酸和106～125位氨基酸；ProtScale疏水性分析發(fā)現(xiàn)，其最小疏水指數(shù)為－2.111，位于第84位的絲氨酸，最大疏水指數(shù)為3.644，，位于第119位的
【作者單位】： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院;
【基金】：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016A020210079)
【分類號(hào)】：S827

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本文編號(hào)：2546713