【摘要】：目的:檢測食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)組織標本及細胞株中β-環(huán)連蛋白抑制基因1(dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 1,DACT1)Cp G島旁區(qū)域及轉錄起始點(transcription start site,TSS)區(qū)域的甲基化狀態(tài),并進一步探討DACT1基因兩個不同區(qū)域甲基化狀態(tài)對基因轉錄及預后的影響。方法:應用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)及RT-PCR的方法檢測ESCC細胞株(TE1、TE13、T.Tn和Eca109)及河北省上消化道腫瘤高發(fā)區(qū)159例ESCC患者癌及相應癌旁組織中DACT1基因兩個不同區(qū)域的甲基化狀態(tài)及m RNA的表達情況。結果:DACT1基因在4株ESCC細胞系中均呈弱表達或陰性表達。應用甲基化抑制劑5-Aza-Dc處理該細胞株后,DACT1 m RNA表達明顯增強;同時,MSP檢測結果顯示,此兩區(qū)域的甲基化條帶均明顯減弱或消失;而應用組蛋白去乙�；敢种苿㏕SA處理細胞株后,該基因在各細胞株中的表達無明顯改變。DACT1 m RNA在ESCC組織中的表達較癌旁組織明顯下調(P0.01),且與該基因TSS區(qū)域異常甲基化狀態(tài)有關(P0.01);DACT1基因Cp G島旁區(qū)域的甲基化頻率在癌及相應癌旁組織中均較高(P0.05),不具有腫瘤組織特異性,且對DACT1基因的轉錄抑制無明顯影響(P0.05);生存分析顯示,DACT1基因TSS區(qū)域的甲基化狀態(tài)與ESCC癌患者的生存期相關(P0.01)。結論:ESCC中DACT1基因TSS區(qū)域的異常高甲基化狀態(tài)是引起其表達下調的機制之一,并有望作為ESCC患者預后的甲基化標志物。
【圖文】：

異常甲基化對食管癌患者預后的影響島旁區(qū)域，即位于CpG島邊緣CpG位點密度相對較低的區(qū)域（region1：-540~-419bp）和環(huán)繞轉錄起始點TSS區(qū)域（region2：-16~105bp）（圖1）甲基化。MSP引物序列及PCR條件見表1。MSP法檢測ESCC及癌旁組織和食管癌細胞株的DACT1基因甲基化狀態(tài)。SssI處理基因組DNA作為甲基化陽性對照（M-PC)組，無消化系統(tǒng)及其他系統(tǒng)腫瘤的正常人外周血DNA作為非甲基化陽性對照(N-PC)組，，滅菌雙蒸水取代DNA模板進行PCR作為陰性對照(NC)組。隨機選取10%標本進行重復實驗。+1:Thetranscriptionstartpoint圖1DACT1基因啟動子區(qū)CpG島分布圖Fig.1DistributionoftheCpGislandsinpromoterofDACT1gene1.5RT-PCR方法檢測DACT1mRNA表達按TRIzol試劑盒說明書提取組織及細胞株總RNA，參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA，用于檢測DACT1mRNA的表達。GAPDH作為內參照，所用引物及退火溫度見表1。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用圖像分析系統(tǒng)Gelwork-2ID對mRNA進行定量。1.6免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)方法檢測DACT1蛋白表達應用常規(guī)SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化。3%甲醇過氧化氫封閉后用EDTA高壓修復2~5min，血清封閉，DACT1抗體孵育過夜，再依次加入生物素化二抗及辣根過氧化物酶標記的三抗，DAB顯色，蘇木精復染。以PBS代替一抗做空白對照。以胞漿內出現(xiàn)均勻一致的棕黃色顆粒視為陽性表達，并依據傳統(tǒng)的染色評分方法[7]對結果進行判定。1.7統(tǒng)計學處理數(shù)據統(tǒng)計分析采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件。各組間甲基化頻率差異分析用χ2檢驗；mRNA表達數(shù)據用表示，差異比較用t檢驗；用Log-rank檢驗分析DACT1基因CpG島旁區(qū)域和TSS區(qū)域甲基化狀態(tài)對ESCC患者生存期的影響。P<0.05或P<0.01表示差?

異常甲基化對食管癌患者預后的影響島旁區(qū)域，即位于CpG島邊緣CpG位點密度相對較低的區(qū)域（region1：-540~-419bp）和環(huán)繞轉錄起始點TSS區(qū)域（region2：-16~105bp）（圖1）甲基化。MSP引物序列及PCR條件見表1。MSP法檢測ESCC及癌旁組織和食管癌細胞株的DACT1基因甲基化狀態(tài)。SssI處理基因組DNA作為甲基化陽性對照（M-PC)組，無消化系統(tǒng)及其他系統(tǒng)腫瘤的正常人外周血DNA作為非甲基化陽性對照(N-PC)組，滅菌雙蒸水取代DNA模板進行PCR作為陰性對照(NC)組。隨機選取10%標本進行重復實驗。+1:Thetranscriptionstartpoint圖1DACT1基因啟動子區(qū)CpG島分布圖Fig.1DistributionoftheCpGislandsinpromoterofDACT1gene1.5RT-PCR方法檢測DACT1mRNA表達按TRIzol試劑盒說明書提取組織及細胞株總RNA，參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA，用于檢測DACT1mRNA的表達。GAPDH作為內參照，所用引物及退火溫度見表1。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用圖像分析系統(tǒng)Gelwork-2ID對mRNA進行定量。1.6免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)方法檢測DACT1蛋白表達應用常規(guī)SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化。3%甲醇過氧化氫封閉后用EDTA高壓修復2~5min，血清封閉，DACT1抗體孵育過夜，再依次加入生物素化二抗及辣根過氧化物酶標記的三抗，DAB顯色，蘇木精復染。以PBS代替一抗做空白對照。以胞漿內出現(xiàn)均勻一致的棕黃色顆粒視為陽性表達，并依據傳統(tǒng)的染色評分方法[7]對結果進行判定。1.7統(tǒng)計學處理數(shù)據統(tǒng)計分析采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件。各組間甲基化頻率差異分析用χ2檢驗；mRNA表達數(shù)據用表示，差異比較用t檢驗；用Log-rank檢驗分析DACT1基因CpG島旁區(qū)域和TSS區(qū)域甲基化狀態(tài)對ESCC患者生存期的影響。P<0.05或P<0.01表示差?
【作者單位】： 河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室;
【基金】：國家自然科學基金資助項目(No.81472335,No.81572441) 河北省自然科學基金資助項目(No.H2013206315)~~
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

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本文編號：2543332