【摘要】：目的:本課題利用公共引物介導(dǎo)的多重PCR技術(shù)(Universal primer-multiplex polymerase chain reaction,UP-MPCR),以我國(guó)批準(zhǔn)進(jìn)口(已經(jīng)頒發(fā)了安全證書(shū))的12種轉(zhuǎn)基因大豆中轉(zhuǎn)基因序列為基因檢測(cè)靶標(biāo),建立一種低成本、高特異性和高效的多重PCR方法體系,研發(fā)適用于加工食品中轉(zhuǎn)基因大豆成分鑒定的核酸檢測(cè)試劑盒。方法:本課題包括設(shè)計(jì)引物、構(gòu)建質(zhì)粒模板、建立多重檢測(cè)體系、多重體系檢測(cè)。本課題中設(shè)計(jì)引物包括公共引物、特異引物和嵌合引物。公共引物設(shè)計(jì)原則:長(zhǎng)度17~20bp、GC%含量合適、無(wú)重復(fù)序列、引物間無(wú)二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)等,經(jīng)過(guò)Blast比對(duì)修改后,要求與以轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA為模板擴(kuò)增無(wú)特異性產(chǎn)物,再以轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA為模板進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,篩選公共引物。將篩選出的3條公共引物通過(guò)PCR連接到一段大豆Lectin基因序列兩端,插入質(zhì)粒載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證后,將陽(yáng)性重組質(zhì)粒梯度稀釋作為模板,用公共引物進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)各公共引物擴(kuò)增的敏感性。通過(guò)文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)和專(zhuān)利等搜索獲得這12種轉(zhuǎn)基因大豆(MON87701、GTS40-3-2、MON89788、CV127、A2704、A5547、DP356043、DP305423、MON87769、MON87708、305423×40-3-2、MON87701×MON89788,其中有兩種為復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆)插入序列和5’、3’側(cè)翼序列,采用品系特異性檢測(cè)方法,在轉(zhuǎn)基因大豆插入序列與大豆基因組的5’或3’側(cè)翼連接區(qū)域設(shè)計(jì)引物,比對(duì)引物,同時(shí)進(jìn)行多重引物比對(duì)。將篩選出的公共引物連接在特異引物的5’端構(gòu)成嵌合引物,將多對(duì)嵌合引物通過(guò)以上同樣的方法進(jìn)行比對(duì)獲得最佳嵌合引物,通過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其特異性及敏感性。本課題目的是構(gòu)建一個(gè)同時(shí)檢測(cè)12種轉(zhuǎn)基因大豆的多重檢測(cè)體系,本體系的建立包括單對(duì)嵌合引物的特異性檢測(cè)、確定擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件、多重檢測(cè)體系的特異性和敏感性檢測(cè)。本體系采用兩步溫度法,前10個(gè)循環(huán)采用高退火溫度(61℃),后30個(gè)循環(huán)采用低退火溫度(54℃)。將10種轉(zhuǎn)基因大豆的部分靶序列和部分大豆Lectin序列,通過(guò)不同的分子克隆方法構(gòu)建了4個(gè)重組質(zhì)粒陽(yáng)性模板,包括含有4個(gè)目的片段的pSOYG1、含有5條目的片段的pSOYG2和2個(gè)只含有1條目的片段的重組質(zhì)粒模板。結(jié)果:本課題成功設(shè)計(jì)并成功篩選出了3條公共引物,與轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA擴(kuò)增無(wú)影響結(jié)果判斷的特異性產(chǎn)物,且公共引物敏感性達(dá)到100個(gè)拷貝。本課題針對(duì)12種轉(zhuǎn)基因大豆和大豆內(nèi)參基因Lectin構(gòu)建了2個(gè)分別含有4個(gè)或5個(gè)目的片段的陽(yáng)性重組質(zhì)粒模板pSOYG1和pSOYG2、2個(gè)只含有單個(gè)插入片段的陽(yáng)性質(zhì)粒模板。其中pSOYG1含有4條目的片段,4條目的片段分別對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因大豆MON87701、GTS 40-3-2、MON89788和內(nèi)參基因Lectin;pSOYG2含有5條目的片段,5條目的片段分別對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12、DP356043、DP305423、CV-127、A5547-127;2個(gè)只含有單個(gè)插入片段的陽(yáng)性質(zhì)粒模板,分別對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因大豆MON87708、MON87769。本課題構(gòu)建了用于12種轉(zhuǎn)基因大豆核酸檢測(cè)的公共引物介導(dǎo)的多重PCR檢測(cè)體系(UP-MPCR),采用了品系特異性檢測(cè)方法,具有高特異性和高敏感性。本體系敏感性達(dá)到了0.1ng,即0.1%(0.1ng/100 ng樣品DNA)。結(jié)論:本課題構(gòu)建的公共引物介導(dǎo)的多重PCR(UP-MPCR)檢測(cè)體系對(duì)12種轉(zhuǎn)基因大豆的核酸檢測(cè)具有較高的敏感性和特異性。該方法準(zhǔn)確、高效和經(jīng)濟(jì),同時(shí),為本檢測(cè)方法推廣應(yīng)用于如西紅柿、玉米、土豆等眾多其它轉(zhuǎn)基因食品的基因檢測(cè)提供參考資料和示范。
【圖文】：

公共引物設(shè)計(jì)篩選流程

含公共引物序列目的片段結(jié)構(gòu)示意圖
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S565.1;Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 Clive James;;2015年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)[J];中國(guó)生物工程雜志;2016年04期

2 蔡軍;李慧;胡夢(mèng)龍;傅洋;汪磊;王璐;;轉(zhuǎn)基因成分分析檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J];食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào);2016年02期

3 鄭金英;翁欣;;國(guó)際轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)中國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)及其期貨市場(chǎng)的影響[J];亞太經(jīng)濟(jì);2015年05期

4 ;中國(guó)農(nóng)科院推出新型轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)試紙[J];中國(guó)食品學(xué)報(bào);2015年03期

5 張忠民;;轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)閾值問(wèn)題研究[J];食品科學(xué);2015年09期

6 Clive James;;2014年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)[J];中國(guó)生物工程雜志;2015年01期

7 閆偉;徐楨惠;龍麗坤;李蔥蔥;李飛武;;應(yīng)用單管半巢式PCR技術(shù)篩查轉(zhuǎn)基因食品[J];食品科學(xué);2015年02期

8 王晨光;許文濤;黃昆侖;羅云波;;轉(zhuǎn)基因食品分析檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J];食品科學(xué);2014年21期

9 朱鵬宇;;利用微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)食品或飼料樣品[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2013年12期

10 Seung-Ah Chung;Michael G.Francom;Kathryn Ting;;韓國(guó)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)年報(bào)(2011年)[J];生物技術(shù)進(jìn)展;2013年01期

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1 段欠欠;公共引物介導(dǎo)的多重PCR技術(shù)在細(xì)菌性腦膜炎診斷中的應(yīng)用研究[D];蘇州大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：2541792