【摘要】：竹葉黃酮(AOB)是一類竹子中提取的黃酮類化合物。許多黃酮類化合物具有雌激素效能,可因劑量差異對(duì)動(dòng)物生殖及胚胎發(fā)育功能產(chǎn)生不同影響。大熊貓是我國(guó)特有珍稀瀕危動(dòng)物,有“國(guó)寶”和“活化石”之稱,低下的生殖力使大熊貓的種群正在走向滅亡。竹子是大熊貓的主要食物來(lái)源,大熊貓的低生殖能力是否會(huì)受到竹葉黃酮在體內(nèi)累積的影響至今尚不清楚。本研究首先采用小鼠胚胎成纖維(MEF)細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞(mESC)分化形成的擬胚體(mEB)為模型,探索AOB對(duì)小鼠生殖及胚胎發(fā)育功能的毒理以及內(nèi)在相關(guān)基因表達(dá)的影響及作用機(jī)制,以期為進(jìn)一步探索竹葉黃酮是否對(duì)大熊貓生殖力具有影響奠定基礎(chǔ)。本研究取得了以下主要結(jié)果：1、AOB對(duì)MEF細(xì)胞的毒理性作用及基因表達(dá)的影響采用形態(tài)觀察、MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)不同濃度AOB對(duì)MEF細(xì)胞增殖的影響作用。結(jié)果表明低濃度AOB (0-10 μg/ml)對(duì)MEF生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用；較高濃度的AOB(≥100μ/ml)對(duì)MEF細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用,且能顯著增強(qiáng)MEF凋亡率。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),AOB可使貼壁的MEF細(xì)胞皺縮,不能維持其梭型狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)確定了AOB對(duì)MEF細(xì)胞的半致死濃度為400μg/ml。根據(jù)表達(dá)譜基因芯片結(jié)果篩選出差異基因792個(gè),其中,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比表達(dá)量上調(diào)2倍以上的基因有478個(gè),下調(diào)的基因有314個(gè)。分析發(fā)現(xiàn),許多差異基因與小鼠生殖功能及胚胎發(fā)育等功能密切相關(guān),篩選出與精卵結(jié)合、精子發(fā)生、精子活力、胚胎發(fā)育及生殖細(xì)胞發(fā)育等生殖功能相關(guān)的GO terms 94個(gè)。同時(shí)KEGG分析發(fā)現(xiàn),許多差異基因參與調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、Wnt、MAPK、 P53、Hippo等生殖及胚胎發(fā)育功能相關(guān)的通路。然后,采用qRT-PCR方法,驗(yàn)證從中篩選的參與細(xì)胞凋亡(負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、酮酸代謝過(guò)程、代謝過(guò)程以及有機(jī)酸代謝過(guò)程等)功能和生殖調(diào)節(jié)(精子發(fā)生、精卵結(jié)合、胚胎發(fā)育等)等功能相關(guān)GO類和通路中的基因20個(gè)(Cxxc4、Fzd1、Sfrp1、Ntrk2、Fgf10、 Kn2、Cpz、Dhrs9、Pla2g4e、Mapk12、Smc3、Lrp6、Cabyr、Pcsk4、Myl2、Pla2g4b、 B23120H23Rik、Rap1a、Pdgfb、Pdgfra)進(jìn)行了表達(dá)檢測(cè),qRT-PCR結(jié)果表明,各基因的表達(dá)趨勢(shì)與表達(dá)譜基因芯片分析結(jié)果基本一致。2、AOB影響MEF細(xì)胞中ERK和Wnt信號(hào)通路的活化程度采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AOB處理前后MEF細(xì)胞中ERK通路及Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)量變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),磷酸化的ERK和(3-catenin表達(dá)量顯著上調(diào),說(shuō)明AOB對(duì)兩條信號(hào)通路具有顯著的激活效應(yīng)。此外,Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AOB處理后,生殖相關(guān)的蛋白(CABYR, SOX17, P450scc)表達(dá)量顯著上調(diào)。而加入ERK通路和Wnt通路抑制劑后,三種蛋白表達(dá)量顯著下調(diào),因而推測(cè),AOB通過(guò)調(diào)控這兩條經(jīng)典通路的激活,影響生殖發(fā)育等功能相關(guān)蛋白的表達(dá)。3、AOB影響mESC分化和mEB的基因表達(dá)通過(guò)采用ALP染色和Oct4的免疫熒光化學(xué)方法鑒定mESC的狀態(tài),采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)處理組和對(duì)照組mEB中三胚層標(biāo)志基因和mES干性標(biāo)志基因的表達(dá),研究AOB對(duì)mEB發(fā)育的影響以及預(yù)測(cè)AOB對(duì)胚胎發(fā)育的效應(yīng)。結(jié)果表明,50 μg/ml和100μg/ml AOB處理后,其mES干性標(biāo)志基因Oct4和Nanog的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著增高,推斷AOB顯著抑制了mESC的分化過(guò)程。50μg/ml AOB處理后,mEB原始外胚層基因Gata6表達(dá)量顯著下調(diào)、而Sox7和Pdgfrb表達(dá)量則顯著上調(diào)；外胚層標(biāo)志基因Nestin和Fgf5表達(dá)量顯著下調(diào)；中胚層標(biāo)志基因Brachyuary表達(dá)量顯著下調(diào),而Flk1則顯著上調(diào)；內(nèi)胚層標(biāo)記基因Afp和Sox17表達(dá)量顯著下調(diào)。100 μg/ml的AOB處理后,mEB原始外胚層基因Gata6、Sox7、Pdgfrb表達(dá)量顯著上調(diào)；外胚層標(biāo)志基因Nestin和Fgf5表達(dá)量顯著下調(diào)；中胚層標(biāo)志基因Brachyuary表達(dá)量顯著下調(diào),而Flk1則顯著上調(diào)；內(nèi)胚層標(biāo)記基因Afp和Sox17表達(dá)量顯著上調(diào)。說(shuō)明AOB顯著影響了mESCh和mEB的基因,推測(cè)AOB可能影響胚胎的早期發(fā)育。表達(dá)譜基因芯片分析結(jié)果顯示,50μg/ml AOB處理后,mEB差異表達(dá)基因數(shù)明顯少于100μg/ml處理組,說(shuō)明AOB濃度越高,對(duì)小鼠生殖功能基因表達(dá)的影響越大。根據(jù)差異基因GO和KEGG分析的數(shù)據(jù),篩選出與小鼠生殖及胚胎發(fā)育功能相關(guān)的差異基因,并進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。認(rèn)為AOB影響小鼠生殖能力及胚胎發(fā)育是復(fù)雜的過(guò)程,可能是通過(guò)調(diào)控與小鼠生殖及胚胎后期發(fā)育、孕酮合成關(guān)鍵酶等功能相關(guān)基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。此外,AOB可顯著影響生殖發(fā)育功能相關(guān)的Wnt及MAPK等信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控基因差異表達(dá),影響通路信號(hào)傳導(dǎo),從而影響小鼠的生殖及胚胎發(fā)育功能。與對(duì)照相比,兩種濃度AOB處理后的mEB中miRNA-294/295/372/373的靶基因Fgf10, miRNA-449abc/34ab的靶基因Pdgfra表達(dá)均顯著上調(diào)。推測(cè)AOB對(duì)小鼠生殖及胚胎發(fā)育功能的影響作用也可能與miRNA調(diào)控相關(guān)。4、AOB影響mEB細(xì)胞中ERK和Wnt信號(hào)通路的活化程度Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AOB處理前后mEB細(xì)胞中ERK通路及Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)量變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),磷酸化的ERK和P-catenin表達(dá)量顯著上調(diào),說(shuō)明AOB對(duì)兩條信號(hào)通路具有顯著的激活效應(yīng)。此外,Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示100μg/ml AOB處理后,生殖相關(guān)的蛋白(CABYR, SOX17, P450scc)表達(dá)量顯著上調(diào)。而加入ERK通路和Wnt通路抑制劑后,三種蛋白表達(dá)量顯著下調(diào),進(jìn)一步證明,AOB通過(guò)調(diào)控這兩條經(jīng)典通路的活化,影響生殖發(fā)育等功能相關(guān)蛋白的表達(dá)。5、AOB影響差異表達(dá)基因的生物學(xué)效應(yīng)為了進(jìn)一步探索AOB對(duì)小鼠生殖及胚胎發(fā)育功能影響作用機(jī)制,生物信息學(xué)預(yù)測(cè)芯片試驗(yàn)中與小鼠生殖及胚胎發(fā)育功能相關(guān)差異基因在調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的作用,以及連接這些信號(hào)的上下游調(diào)控基因節(jié)點(diǎn),進(jìn)一步探索AOB影響小鼠生殖及胚胎發(fā)育功能的機(jī)制。通過(guò)IPA分析差異基因所導(dǎo)致的下游生物學(xué)效應(yīng),即疾病和功能分析,結(jié)果顯示AOB作用后產(chǎn)生的差異表達(dá)基因主要在多種腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、骨骼肌病等相關(guān)疾病中富集。信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因主要在MAPK、Wnt、p53和PI3K/AKT等信號(hào)途徑中富集�？傊�,通過(guò)MEF和mEB細(xì)胞模型研究,發(fā)現(xiàn)特定濃度的AOB對(duì)動(dòng)物的胚胎發(fā)育和胚胎生殖具有明顯的毒性作用。也為進(jìn)一步探索大熊貓生殖力降低的原因和機(jī)理提供一種思路。
【圖文】：

圖２－１不同濃度ＡＯＢ處理后的ＭＥＦ細(xì)胞不同時(shí)間段形恣現(xiàn)察逡逑－Ｄ行代表濃度依次為０、１００、５００、８００邋Ｍｇ／ｍｌ的ＡＯＢ處理后的Ｍ邸細(xì)胞；由左至逡逑細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間依次為培養(yǎng)２４、４８、７２ｈ的ＭＥＦ細(xì)胞；ＡＯＢ處理后，細(xì)胞增殖緩慢，逡逑度ＡＯＢ處理下細(xì)胞巧態(tài)變化不大（Ｂ１－Ｂ３）但在較高濃度ＡＯＢ作用下，ＭＥＦ細(xì)胞逡逑

的ＭＥＦ細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示：ＡＯＢ濃度在Ｏ．ｌｕｇ／ｍｌ？ｌ0ｎｇ／ｍｌ時(shí)，ＡＯＢ對(duì)逡逑ＭＥＦ細(xì)胞的增殖有顯著的促進(jìn)作用，，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，王組不同濃度ＡＯＢ逡逑（０．１，１，１０峭／ｍｌ）處理后，細(xì)胞活性具有顯著性差異（圖２－２），當(dāng)ＡＯＢ濃度逡逑達(dá)到１００［１３／１１１１時(shí)，其對(duì)ＭＥＦ細(xì)胞增殖即產(chǎn)生顯著抑制作用。逡逑１．５－｜逡逑ｙ逡逑｜ｌ．２－邐巧逡逑巧邐內(nèi)口逡逑ｑＯ－９邋—Ｉ邐Ａ逡逑Ｏ逡逑０）逡逑之０．６逡逑巧逡逑巧逡逑Ｋ０．３－逡逑０．０邋Ｉ邋＾邋＂１邋■邋￣￣＿＿＿Ｌ＾邋—逡逑０邋０．１邋１邐１０邋１００逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒ＊ａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＯＢ邋（ｕｇ／ｍｌ）逡逑圖２－２低濃度ＡＯＢ對(duì)ＭＥＦ細(xì)胞增殖的影響逡逑ＭＴＴ實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度ＡＯＢ邋（０？１００｜ｉｇ／ｍｌ）對(duì)ＭＥＦ細(xì)胞的X椫車撓跋熳饔�，结果显蜀x阱義系團(tuán)ǘ認(rèn)攏ǎ跡

本文編號(hào)：2540255