【摘要】：親環(huán)蛋白10(Cyclophilin 10,Cyp10)是親環(huán)蛋白家族成員之一,這是一類廣泛存在于真核及原核生物內(nèi)的蛋白家族,其共性是都具有肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerases,PPIase)活性。有研究表明,Cyp10可能參與了腫瘤細(xì)胞凋亡蛋白胞質(zhì)分布的調(diào)控,但在昆蟲先天免疫中的作用沒(méi)有見(jiàn)到報(bào)道。本研究以斜紋夜蛾Spodoptera litura為研究對(duì)象,以寄生后斜紋夜蛾血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的特異cyp10序列為基礎(chǔ),通過(guò)RT-PCR克隆出了cyp10基因,通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)此序列進(jìn)行開放閱讀框分析(Open Reading Frame,ORF)和序列同源性比對(duì),發(fā)現(xiàn)cyp10基因ORF全長(zhǎng)486 bp,編碼161個(gè)氨基酸,具有肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶家族標(biāo)簽序列:YNGSLFHRNIKGFIVQTG,因此確定為親環(huán)蛋白基因家族成員。構(gòu)建了包括ORF全長(zhǎng)編碼區(qū)的原核表達(dá)載體p ET32a-Cyp10及真核表達(dá)載體p IZT/V5-His-Cyp10,經(jīng)Western blot證明,p ET32a-Cyp10和p IZT/V5-His-Cyp10可分別在大腸桿菌和鱗翅目昆蟲細(xì)胞系(Hi5,Sf9和Spli221)中表達(dá),蛋白分子量分別是26 k Da和22 k Da。之后以細(xì)胞免疫熒光定位法探索Cyp10在家蠶細(xì)胞Bm N內(nèi)的分布,發(fā)現(xiàn)Cyp10主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。這些結(jié)果為進(jìn)一步探索Cyp10在昆蟲先天免疫中的作用奠定了一定基礎(chǔ)。
【圖文】：

)洗兩次(10min×2)，再加入二抗AlexaFluor溲568GoatAnti-ＲabbitlgG(H+L)(1∶2000)孵育1h。1×PBS洗兩次(5min×2)，加入鬼筆環(huán)肽稀釋40倍(1×PBS配制)，37℃孵育30－60min。1×PBS洗一次(5min)。加入DAPI(終濃度為300nmol/L)室溫孵育5min。熒光顯微鏡觀察。2結(jié)果與分析2.1斜紋夜蛾cyp10基因的克隆通過(guò)對(duì)寄生后斜紋夜蛾血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的分析，，獲得了cyp10基因cDNA的預(yù)測(cè)序列。以此為模板，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以提取斜紋夜蛾血細(xì)胞mＲNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，PCＲ擴(kuò)增獲得了一條490bp的特異性片段(圖1)。通過(guò)NCBI在線OＲF查找工具，找到了特異的cyp10基因序列，根據(jù)OＲF設(shè)計(jì)了帶有酶切位點(diǎn)的引物(表1)，為后面表達(dá)載體的構(gòu)建做準(zhǔn)備。圖1斜紋夜蛾中cyp10基因的PCＲ擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1PCＲproductofcyp10inSpodopteralitura590

環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)JournalofEnvironmentalEntomology39卷圖2斜紋夜蛾Cyp10與其它物種的同源比對(duì)Fig.2MultiplesequencealignmentofCyp10fromSpodopteraliturawiththosefromotherspecies注:實(shí)心箭頭指示的是親環(huán)蛋白家族標(biāo)簽序列;空心箭頭指示的是磷酸化位點(diǎn)。大紅斑蝶，EHJ72048.1;家蠶，XP_004928560.1;人類，NP_570981.1;斑馬魚，NP_001002146.1。Note:ThesolidarrowindicatesthetagsequenceofCyclophilinproteinfamily;thehollowarrowindicatesthephosphorylationsites.Danausplexippus，EHJ72048.1;Bombyxmori，XP_004928560.1;Homosapiens，NP_570981.1);Daniorerio，NP_001002146.1．圖3斜紋夜蛾Cyp10與其他物種Cyps的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3PhylogeneticanalysisbasedonaminoacidsequencesofSpliCyp10proteinandotherinsectcyclophilinproteins592
【作者單位】： 云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院云南省高校動(dòng)物遺傳多樣性和進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家自然基金項(xiàng)目(31360454,31260448,31560528) 云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2012FB120)
【分類號(hào)】：S433.4

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本文編號(hào)：2533277