【摘要】：通過生物信息學(xué)分析,在本實驗室分離得到的1株羽毛高效降解菌微白黃鏈霉菌Fea-10基因組中發(fā)現(xiàn)基因gm2886(GenBank Accession Number:KY368946)可能編碼一新的角蛋白酶,通過在該基因5'端和3'端分別連接紅霉素抗性基因啟動子(PermE)和組氨酸標(biāo)簽編碼序列并構(gòu)建在大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pSET152上,接合轉(zhuǎn)入密旋鏈霉菌Streptomyces pactum ACT12,從而實現(xiàn)了異源表達,蛋白純化后對其酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。實驗結(jié)果表明,帶有組氨酸標(biāo)簽編碼序列的gm2886在密旋鏈霉菌ACT12中可以表達分泌得到1個大小約為36 kDa的蛋白。多種底物檢測表明異源表達得到的重組蛋白GM2886-His6具有蛋白酶活性,可以降解水不溶性的天青角蛋白和羽毛粉;其最適溫度和pH分別為50℃和pH 10.0。PMSF可抑制GM2886-His6的酶活,而EDTA不能,說明該酶為絲氨酸蛋白酶。本研究為從分子水平上解析羽毛高效降解菌Fea-10的活性機理,從而進一步開發(fā)其應(yīng)用潛力提供了基礎(chǔ),同時可為該類蛋白酶的研究提供借鑒。
【圖文】：

馬怡茗等/角蛋白酶基因gm2886在密旋鏈霉菌ACT12中的表達及鑒定：010-64807509：cjb@im.ac.cn1973圖1GM2886與幾種已知的鏈霉菌來源角蛋白酶的成熟酶序列同源性分析Fig.1SequencealignmentofmatureproteinsequenceofGM2886andseveralotherknownkeratinases.圖2密旋鏈霉菌ACT12/pSET152::Perm::gm2886牛奶平板復(fù)篩Fig.2SecondaryscreeningofStreptomycespactumACT12/pSET152::Perm::gm2886usingmilk-agarplate.1:wildtypeACT12;2:ACT12/pSET152::Perm::gm2886.使用酪蛋白為底物進行非變性蛋白電泳，在重組蛋白對應(yīng)位置可以出現(xiàn)透明條帶(圖4)，表明該純化到的蛋白具有蛋白水解活性。3.3重組蛋白GM2886-His6的產(chǎn)量與酶活對純化到的重組蛋白產(chǎn)量進行測定，得到重組蛋白GM2886-His6在密旋鏈霉菌ACT12中的異源表達產(chǎn)量為1.108mg/L。以酪蛋白為底物測得重組蛋白的最大酶活為5.36kU/mg。

馬怡茗等/角蛋白酶基因gm2886在密旋鏈霉菌ACT12中的表達及鑒定：010-64807509：cjb@im.ac.cn1973圖1GM2886與幾種已知的鏈霉菌來源角蛋白酶的成熟酶序列同源性分析Fig.1SequencealignmentofmatureproteinsequenceofGM2886andseveralotherknownkeratinases.圖2密旋鏈霉菌ACT12/pSET152::Perm::gm2886牛奶平板復(fù)篩Fig.2SecondaryscreeningofStreptomycespactumACT12/pSET152::Perm::gm2886usingmilk-agarplate.1:wildtypeACT12;2:ACT12/pSET152::Perm::gm2886.使用酪蛋白為底物進行非變性蛋白電泳，在重組蛋白對應(yīng)位置可以出現(xiàn)透明條帶(圖4)，，表明該純化到的蛋白具有蛋白水解活性。3.3重組蛋白GM2886-His6的產(chǎn)量與酶活對純化到的重組蛋白產(chǎn)量進行測定，得到重組蛋白GM2886-His6在密旋鏈霉菌ACT12中的異源表達產(chǎn)量為1.108mg/L。以酪蛋白為底物測得重組蛋白的最大酶活為5.36kU/mg。
【作者單位】： 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;中國科學(xué)院微生物研究所;
【基金】：陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)(No.2015NY066) 上海交通大學(xué)微生物代謝國家重點實驗室開放基金(No.MMLKF14-09) 中央高�；究蒲袠I(yè)務(wù)費(Nos.Z109021426,Z109021432) 國家自然科學(xué)基金(No.31601700)資助~~
【分類號】：Q78

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本文編號：2524574