【摘要】：巨桉為重要用材樹種,生長迅速,為我國林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展做出重要貢獻。但其對低溫敏感,不耐干旱、鹽漬,且不良環(huán)境常對桉樹生產(chǎn)造成重大損失。因此,研究其非生物逆境脅迫響應的分子機制,挖掘桉樹抗逆分子調(diào)控中發(fā)揮重要作用的基因,對桉樹抗逆分子輔助育種意義重大。EgrZFP7是參與低溫和高鹽等逆境因子響應的一個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄因子。以擬南芥C2H2型鋅指蛋白分類為依據(jù),通過聚類分析結(jié)果表明EgrZFP7為C1-2iA類鋅指蛋白。其編碼蛋白除含有兩個高度保守,核心序列為QALGGH的鋅指結(jié)構(gòu)域外,還含有1個與蛋白互作相關,富含亮氨酸(Leu)的L-box結(jié)構(gòu)域,1個與轉(zhuǎn)錄活性相關的乙烯響應元件結(jié)合因子相關雙性抑制子EAR基序(ERF-associated amphiphilic repression domain),也稱為DLN-box�；騿幼有蛄猩线�含有ABRE、DREB和NACF等多個與逆境脅迫相關的順式作用元件。4℃不同處理時間(0,2,6,12,24,48h)下篩選得到832個與EgrZFP7共表達基因(cor絕對值0.9)。KEGG結(jié)果表明,有117個基因可與KEGG途徑匹配,其中有71個基因參與基礎代謝和次生代謝途徑,22個基因參與氨基酸代謝途徑,19個基因參與糖代謝。對EgrZFP7正向共表達相關系數(shù)最高的20個基因進行分析,發(fā)現(xiàn)其中有多個涉及逆境脅迫響應相關的轉(zhuǎn)錄因子如MYB、WRKY和ZFP轉(zhuǎn)錄因子家族成員等,同時有4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因。說明這些基因在巨桉低溫逆境響應中,可能與EgrZFP7存在協(xié)同作用或調(diào)控關系。EgrZFP7超表達擬南芥轉(zhuǎn)化植株中,側(cè)根數(shù)目和長度有明顯的增加和伸長,但超表達轉(zhuǎn)基因株系低溫下敏感程度提高,PEG處理下表現(xiàn)為不定根的伸長受到誘導,而高鹽處理下并沒有表現(xiàn)出敏感程度的變化。為進一步研究EgrZFP7的功能,構(gòu)建了PMAL-C2X-Egr ZFP7原核表達載體,進行表達條件篩選與優(yōu)化。結(jié)果表明,該蛋白可在Transetta(DE3)菌株中經(jīng)0.4mmol?L-1IPTG誘導,在20℃環(huán)境中培養(yǎng)14h后在上清中大量表達。對原核表達的EgrZFP7蛋白純化后,利用CASTing手段篩選EgrZFP7蛋白結(jié)合的核心序列。在所分離的片段中,其一致性很強的序列中都含有兩個連續(xù)的胸腺嘧啶(T),進行多序列比對和構(gòu)建隱馬圖分析結(jié)果也表明該核心序列至少含有兩個連續(xù)的堿基T,核心序列可能為[TG][TG][CA]TT[AG][TC][TG]。本研究通過異源轉(zhuǎn)化手段,蛋白表達以及CASTing技術,對EgrZFP7基因在巨桉非生物逆境響應中的功能和調(diào)控機制,進行初步研究,豐富了巨桉非生物逆境抗性相關分子機制,為巨桉抗逆分子輔助育種工作提供了一定的理論參考。
【圖文】：

圖 1.1 響應滲透和低溫脅迫基因表達調(diào)控網(wǎng)絡[20]（Kazuko 等，2006）Fig.1.1 Response to osmotic and hypothermic stress gene expression regulation networks(Kazukoet al,2005)1.1.2.1ABA 依賴途徑該途徑中，脅迫基因表達依賴內(nèi)源 ABA 累積和外源 ABA 添加。研究表明擬南芥 AREB/ABF 基因家族基因 AREB1、AREB2 及 AREB3（ABA responsive elementbinding protein）可被干旱、高鹽和 ABA 誘導表達，其中 AREB1 和 AREB2 的表達需ABA 激活[21]。擬南芥 ABF2/AREB1 參與 ABA 依賴信號途徑，該基因可被高鹽脅迫和干旱脅迫誘導表達，其擬南芥超表達植株在應對干旱、高鹽、高溫和氧脅迫時抗性顯著提高。擬南芥 ABF3 或 ABF4/AREB2 參與 ABA 信號傳導途徑，組成型超表達該基因可減弱蒸騰作用并顯著提高超表達植株耐干旱能力[22]。擬南芥 CIPK3 基因響應ABA、低溫、高鹽和干旱脅迫，并參與 ABA 信號途徑，但響應冷脅迫時需要依賴內(nèi)源 ABA 的大量累積[23]。番茄（Lycopersicon esculentum）基因 SIAREB1 可被干旱和高鹽誘導表達，該基因在擬南芥中組成型表達，在外源 ABA 處理下，擬南芥超表達植株中逆境相關基因 AtRD29A 和 AtCOR47 表達量顯著增加[24]。水稻 OsABF2 基因可被干旱、高鹽、低溫、氧脅迫和 ABA 誘導表達，其超表達植株對干旱、高鹽和氧化脅

根據(jù)半胱氨酸（C）和組氨酸（H）殘基數(shù)目和位置可將鋅指蛋白分為 C2H2、C2HC、C2C2、C2HCC2C2、C2C2C2C2 等亞類[55]。從鋅指蛋白結(jié)構(gòu)特征和所發(fā)揮功能差異方面可將鋅指蛋白分為 WRKY、GATA、PHD、DOF 和 TFⅢA 蛋白等亞類[56, 57]。絕大多數(shù)TFⅢA類鋅指蛋白都屬于C2H2型鋅指蛋白。該類鋅指蛋白鋅指結(jié)構(gòu)域（Zincfinger domain）由約 30 個氨基酸組成，核心序列為 CX2-4CX3FX5LX2HX3-5，，該結(jié)構(gòu)域內(nèi)鋅與兩個半胱氨酸和及兩個組氨酸結(jié)合形成配位鍵，構(gòu)型成含有 α 螺旋和 β 發(fā)夾的鋅指結(jié)構(gòu)域。不同植物 C2H2 型鋅指蛋白所含鋅指結(jié)構(gòu)域數(shù)目為 1-4 個，其結(jié)構(gòu)域 α螺旋區(qū)一般含有一段植物所特有的高度保守 QALGGH 序列[58]。該類鋅指蛋白序列往往還包含一個與亞細胞定位相關的核定位信號區(qū) B-box/NLS,一個與蛋白互作的富含亮氨酸（Leu）的 L-box 結(jié)構(gòu)域和一個靠近 C 端與轉(zhuǎn)錄活性相關的乙烯響應元件結(jié)合因子相關雙性抑制子 EAR 基序/DLN-box（圖 1.2b）。研究表明，缺少 B-box 結(jié)構(gòu)域后，擬南芥蛋白 AtZFP11 與 GFP 不能融合，無法在細胞核表達[59]。有一些鋅指蛋白沒有 B-box 結(jié)構(gòu)域，有一些沒有 L-box 結(jié)構(gòu)域，但大部分都含有 DLN-box 結(jié)構(gòu)域[55]。ZPT2-3、STZ 和 CAZFP1 缺失 EAR 結(jié)構(gòu)域其轉(zhuǎn)錄活性會被抑制[60, 61]。
【學位授予單位】：浙江農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S792.39

【參考文獻】

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本文編號：2521144