【摘要】：巨桉為重要用材樹種,生長迅速,為我國林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展做出重要貢獻(xiàn)。但其對低溫敏感,不耐干旱、鹽漬,且不良環(huán)境常對桉樹生產(chǎn)造成重大損失。因此,研究其非生物逆境脅迫響應(yīng)的分子機制,挖掘桉樹抗逆分子調(diào)控中發(fā)揮重要作用的基因,對桉樹抗逆分子輔助育種意義重大。EgrZFP7是參與低溫和高鹽等逆境因子響應(yīng)的一個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄因子。以擬南芥C2H2型鋅指蛋白分類為依據(jù),通過聚類分析結(jié)果表明EgrZFP7為C1-2iA類鋅指蛋白。其編碼蛋白除含有兩個高度保守,核心序列為QALGGH的鋅指結(jié)構(gòu)域外,還含有1個與蛋白互作相關(guān),富含亮氨酸(Leu)的L-box結(jié)構(gòu)域,1個與轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的乙烯響應(yīng)元件結(jié)合因子相關(guān)雙性抑制子EAR基序(ERF-associated amphiphilic repression domain),也稱為DLN-box�；騿幼有蛄猩线�含有ABRE、DREB和NACF等多個與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件。4℃不同處理時間(0,2,6,12,24,48h)下篩選得到832個與EgrZFP7共表達(dá)基因(cor絕對值0.9)。KEGG結(jié)果表明,有117個基因可與KEGG途徑匹配,其中有71個基因參與基礎(chǔ)代謝和次生代謝途徑,22個基因參與氨基酸代謝途徑,19個基因參與糖代謝。對EgrZFP7正向共表達(dá)相關(guān)系數(shù)最高的20個基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其中有多個涉及逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如MYB、WRKY和ZFP轉(zhuǎn)錄因子家族成員等,同時有4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因。說明這些基因在巨桉低溫逆境響應(yīng)中,可能與EgrZFP7存在協(xié)同作用或調(diào)控關(guān)系。EgrZFP7超表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)化植株中,側(cè)根數(shù)目和長度有明顯的增加和伸長,但超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系低溫下敏感程度提高,PEG處理下表現(xiàn)為不定根的伸長受到誘導(dǎo),而高鹽處理下并沒有表現(xiàn)出敏感程度的變化。為進(jìn)一步研究EgrZFP7的功能,構(gòu)建了PMAL-C2X-Egr ZFP7原核表達(dá)載體,進(jìn)行表達(dá)條件篩選與優(yōu)化。結(jié)果表明,該蛋白可在Transetta(DE3)菌株中經(jīng)0.4mmol?L-1IPTG誘導(dǎo),在20℃環(huán)境中培養(yǎng)14h后在上清中大量表達(dá)。對原核表達(dá)的EgrZFP7蛋白純化后,利用CASTing手段篩選EgrZFP7蛋白結(jié)合的核心序列。在所分離的片段中,其一致性很強的序列中都含有兩個連續(xù)的胸腺嘧啶(T),進(jìn)行多序列比對和構(gòu)建隱馬圖分析結(jié)果也表明該核心序列至少含有兩個連續(xù)的堿基T,核心序列可能為[TG][TG][CA]TT[AG][TC][TG]。本研究通過異源轉(zhuǎn)化手段,蛋白表達(dá)以及CASTing技術(shù),對EgrZFP7基因在巨桉非生物逆境響應(yīng)中的功能和調(diào)控機制,進(jìn)行初步研究,豐富了巨桉非生物逆境抗性相關(guān)分子機制,為巨桉抗逆分子輔助育種工作提供了一定的理論參考。
【圖文】：

圖 1.1 響應(yīng)滲透和低溫脅迫基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[20]（Kazuko 等，2006）Fig.1.1 Response to osmotic and hypothermic stress gene expression regulation networks(Kazukoet al,2005)1.1.2.1ABA 依賴途徑該途徑中，脅迫基因表達(dá)依賴內(nèi)源 ABA 累積和外源 ABA 添加。研究表明擬南芥 AREB/ABF 基因家族基因 AREB1、AREB2 及 AREB3（ABA responsive elementbinding protein）可被干旱、高鹽和 ABA 誘導(dǎo)表達(dá)，其中 AREB1 和 AREB2 的表達(dá)需ABA 激活[21]。擬南芥 ABF2/AREB1 參與 ABA 依賴信號途徑，該基因可被高鹽脅迫和干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其擬南芥超表達(dá)植株在應(yīng)對干旱、高鹽、高溫和氧脅迫時抗性顯著提高。擬南芥 ABF3 或 ABF4/AREB2 參與 ABA 信號傳導(dǎo)途徑，組成型超表達(dá)該基因可減弱蒸騰作用并顯著提高超表達(dá)植株耐干旱能力[22]。擬南芥 CIPK3 基因響應(yīng)ABA、低溫、高鹽和干旱脅迫，并參與 ABA 信號途徑，但響應(yīng)冷脅迫時需要依賴內(nèi)源 ABA 的大量累積[23]。番茄（Lycopersicon esculentum）基因 SIAREB1 可被干旱和高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，該基因在擬南芥中組成型表達(dá)，在外源 ABA 處理下，擬南芥超表達(dá)植株中逆境相關(guān)基因 AtRD29A 和 AtCOR47 表達(dá)量顯著增加[24]。水稻 OsABF2 基因可被干旱、高鹽、低溫、氧脅迫和 ABA 誘導(dǎo)表達(dá)，其超表達(dá)植株對干旱、高鹽和氧化脅

根據(jù)半胱氨酸（C）和組氨酸（H）殘基數(shù)目和位置可將鋅指蛋白分為 C2H2、C2HC、C2C2、C2HCC2C2、C2C2C2C2 等亞類[55]。從鋅指蛋白結(jié)構(gòu)特征和所發(fā)揮功能差異方面可將鋅指蛋白分為 WRKY、GATA、PHD、DOF 和 TFⅢA 蛋白等亞類[56, 57]。絕大多數(shù)TFⅢA類鋅指蛋白都屬于C2H2型鋅指蛋白。該類鋅指蛋白鋅指結(jié)構(gòu)域（Zincfinger domain）由約 30 個氨基酸組成，核心序列為 CX2-4CX3FX5LX2HX3-5，，該結(jié)構(gòu)域內(nèi)鋅與兩個半胱氨酸和及兩個組氨酸結(jié)合形成配位鍵，構(gòu)型成含有 α 螺旋和 β 發(fā)夾的鋅指結(jié)構(gòu)域。不同植物 C2H2 型鋅指蛋白所含鋅指結(jié)構(gòu)域數(shù)目為 1-4 個，其結(jié)構(gòu)域 α螺旋區(qū)一般含有一段植物所特有的高度保守 QALGGH 序列[58]。該類鋅指蛋白序列往往還包含一個與亞細(xì)胞定位相關(guān)的核定位信號區(qū) B-box/NLS,一個與蛋白互作的富含亮氨酸（Leu）的 L-box 結(jié)構(gòu)域和一個靠近 C 端與轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的乙烯響應(yīng)元件結(jié)合因子相關(guān)雙性抑制子 EAR 基序/DLN-box（圖 1.2b）。研究表明，缺少 B-box 結(jié)構(gòu)域后，擬南芥蛋白 AtZFP11 與 GFP 不能融合，無法在細(xì)胞核表達(dá)[59]。有一些鋅指蛋白沒有 B-box 結(jié)構(gòu)域，有一些沒有 L-box 結(jié)構(gòu)域，但大部分都含有 DLN-box 結(jié)構(gòu)域[55]。ZPT2-3、STZ 和 CAZFP1 缺失 EAR 結(jié)構(gòu)域其轉(zhuǎn)錄活性會被抑制[60, 61]。
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S792.39

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2521144