發(fā)布時(shí)間：2019-07-26 09:32

【摘要】：利用免疫細(xì)胞熒光、RNA干涉(RNA interfere,RNAi)、qRT-PCR、Western blot及細(xì)胞計(jì)數(shù)等方法,設(shè)計(jì)合成三對(duì)小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)(siRNA-hnRNP K-1,2,3),對(duì)小鼠精原細(xì)胞中內(nèi)源性的不均一性核糖核蛋白K(Heterogeneous ribonucleoproteins K,hnRNP K)進(jìn)行敲低并對(duì)其沉默效率進(jìn)行篩選,研究其對(duì)小鼠精原細(xì)胞存活的影響.結(jié)果表明,siRNA-hnRNP K-3對(duì)小鼠精原細(xì)胞具有80%以上的沉默效率,轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目明顯減少,說明沉默hnRNP K基因的表達(dá)對(duì)小鼠精原細(xì)胞的存活有顯著影響.
【圖文】：

轉(zhuǎn)膜（６０Ｖ，２ｈ），脫脂奶粉封閉２ｈ，４℃一抗孵育過夜，二抗室溫孵育２ｈ，最后使用ＥＣＬ發(fā)光試劑盒在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中自動(dòng)顯色成像．２結(jié)果與分析２．１ｈｎＲＮＰＫ在小鼠精原細(xì)胞中的表達(dá)通過免疫細(xì)胞熒光技術(shù)檢測ｈｎＲＮＰＫ在ＧＣ－１ｓｐｇ細(xì)胞的表達(dá)及定位，結(jié)果顯示帶有紅色熒光標(biāo)記信號(hào)的ｈｎＲＮＰＫ與細(xì)胞核著色的ＤＡＰＩ藍(lán)色熒光信號(hào)強(qiáng)烈且均勻，二者完全重合，如圖１，表明ｈｎＲＮＰＫ主要在ＧＣ－１ｓｐｇ的細(xì)胞核中具有強(qiáng)表達(dá)．圖１ｈｎＲＮＰＫ在ＧＣ－１ｓｐｇ細(xì)胞中的表達(dá)Ｆｉｇ．１ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｎＲＮＰＫｉｎＧＣ－１ｓｐｇｃｅｌｌ２．２ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ干擾效率篩選由以上免疫細(xì)胞熒光的結(jié)果可知，ｈｎＲＮＰＫ在ＧＣ－１ｓｐｇ細(xì)胞核中高表達(dá)，提示其可能對(duì)精原細(xì)胞存活發(fā)揮作用．于是設(shè)計(jì)合成３對(duì)ｈｎＲＮＰＫ的干擾序列（ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－１，２，３）及１對(duì)陰性對(duì)照序列（ｓｉＲＮＡ－ＮＣ）（見表１）．轉(zhuǎn)染ＧＣ－１ｓｐｇ細(xì)胞設(shè)置ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染組（ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－１、２、３）、陰性對(duì)照組（ｓｉＲＮＡ－ＮＣ）及空白對(duì)照組（Ｍｏｃｋ）三個(gè)組別，４８ｈ后，通過ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測干擾效率．結(jié)果表明：與對(duì)照組ｓｉＲＮＡ－ＮＣ及Ｍｏｃｋ相比３對(duì)ｓｉＲ－ＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ均產(chǎn)生５０％以上的干擾效率，其中ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３干擾效率在８０％以上，效果最好（見圖２）．于是選擇ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)．

圖２ｑＲＴ－ＰＣＲ篩選ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ干擾效果Ｆｉｇ．２ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｆｆｅｃｔｓｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｑＲＴ－ＰＣＲ．注：帶有不同小寫字母表示基因表達(dá)水平差異顯著（ｐ＜０．０５）進(jìn)一步用胰酶將其消化成單細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果如表２所示，表明轉(zhuǎn)染４８ｈ后，與對(duì)照組相比較，ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)目顯著低于對(duì)照組（Ｐ＜０．０５），且兩個(gè)對(duì)照組之間差異不顯著（Ｐ＞０．０５）．表２ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３轉(zhuǎn)染ＧＣ－１ｓｐｇ４８ｈ后細(xì)胞計(jì)數(shù)Ｔａｂ．２ＧＣ－１ｓｐｇｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇａｆｔｅｒｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｆｏｒ４８ｈ組別接種細(xì)胞數(shù)目轉(zhuǎn)染４８ｈ后細(xì)胞數(shù)目ｓｉＲＮＡ－ＮＣ６×１０４３．８３±０．１２×１０５ａＭｏｃｋ６×１０４３．８０±０．１１×１０５ａｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３６×１０４１．５７±０．０６×１０５ｂ注：帶有不同小寫字母表示基因表達(dá)水平差異顯著（ｐ＜０．０５）利用ｑＲＴ－ＰＣＲ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技術(shù)分別從ＲＮＡ及蛋白質(zhì)角度檢測ｓｉＲＮＡ對(duì)ｈｎＲＮＰＫ的沉默效果，結(jié)果檢測干擾效率均達(dá)到８０％以上（見圖４），可見ＧＣ－１ｓｐｇ內(nèi)源性的ｈｎＲＮＰＫ被成功抑制．圖３ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３轉(zhuǎn)染４８ｈ后ＧＣ－１ｓｐｇ的細(xì)胞表型Ｆｉｇ．３ＧＣ－１ｓｐｇｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｆｔｅｒｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒ４８ｈＡ．ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測干擾效
【作者單位】： 信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1204326) 河南省青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目(2015GGJS-139) 河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(18B230011)
【分類號(hào)】：Q132.1;Q78

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本文編號(hào)：2519482