【摘要】：鎘是一種嚴(yán)重的環(huán)境污染物,對人體具有致癌性,能蓄積在生物體內(nèi)影響機(jī)體的生長、發(fā)育和生殖。有絲分裂原蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和分化中是重要的信號分子,并能夠被鎘脅迫激活。釀酒酵母中2個(gè)MAPK信號傳導(dǎo)途徑,高滲透壓甘油(High Osmolarity Glycerol,HOG)途徑和細(xì)胞壁完整性(Cell Wall Integrity,CWI)途徑都參與Cd2+脅迫下的細(xì)胞應(yīng)答。為了進(jìn)一步研究這兩條途徑在調(diào)控Cd2+脅迫方面的相互作用,以HOG途徑的蛋白激酶SSK2基因?yàn)槔?通過合成遺傳陣列(Synthetic Genetic Array,SGA)方法,成功構(gòu)建了SSK2基因與其他52個(gè)Cd2+耐受相關(guān)基因之間的雙基因缺失菌株。為大規(guī)模研究Cd2+耐受基因之間在調(diào)控鎘脅迫方面的遺傳學(xué)相互作用奠定了基礎(chǔ),也為釀酒酵母的相關(guān)研究提供了一個(gè)新的遺傳學(xué)手段。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： ?個(gè)CWI信號途徑的組分［11］。為了研究HOG和CWI兩個(gè)途徑之間，以及它們和其他Cd2+耐受性相關(guān)基因之間，在調(diào)控Cd2+脅迫方面的遺傳相互作用，需要構(gòu)建HOG和CWI信號途徑組分基因之間以及它們和其他基因之間的雙基因缺失突變株。為了建立這個(gè)大規(guī)模構(gòu)建雙基因缺失突變株的方法，這里僅以SSK2基因?yàn)槔瑪M構(gòu)建SSK2與其他88個(gè)與Cd2+耐受有關(guān)的基因之間的雙基因缺失株。本研究利用SGA方法［14-15］的原理進(jìn)行構(gòu)建。首先獲得Y2454背景下的ssk2::natMX4單基因缺失株作為靶菌株，其基因型驗(yàn)證如圖1B。圖1Y2454背景里的靶菌株ssk2::natMX4構(gòu)建Fig．1Generationofthessk2::natMX4mutantinY2454backgroundA:PCＲ擴(kuò)增BY4741背景里ssk2::kanMX4敲除盒(第1泳道);CK:BY4741菌株里野生型SSK2基因片段的PCＲ;B:Y2454背景里ssk2::natMX4基因型驗(yàn)證(第1泳道);CK:Y2454菌株里缺失基因ssk2::kanMX4片段的PCＲA:PCＲamplificationofthessk2::kanMX4cassettefromtheBY4741background;CK:PCＲamplificationoftheSSK2genefromtheBY4741background;B:Genotypeverificationofthessk2::natMX4alleleintheY2454background;CK:PCＲam-plificationofthessk2::kanMX4alleleintheY2454background1期熊兵等:釀酒酵母中SSK2基因與其他鎘耐受相關(guān)基因之間的雙基因缺失菌株構(gòu)建53
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 2．2SGA缺失株陣列的獲得為了提高菌株構(gòu)建效率，將88個(gè)BY4741背景下的基因缺失株依次點(diǎn)接在影印板的a、b、c和d四個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域的菌株及排列順序都相同(圖2)。圖288個(gè)SGA缺失株陣列分布Fig．2Distributionof88SGAgenedeletionmutantsarraya、b、c和d四個(gè)區(qū)域均有96個(gè)點(diǎn)接位置，影印板中裝有YPD+150μg/mLG418固體培養(yǎng)基。30℃培養(yǎng)1dEachoffourdistrictsofa，b，canddhas96spotsforinoc-ulation．TheplatecontainingYPD+150μg/mLG418solidmediumisculturedforonedayat30℃2．3SGA篩選雙基因缺失株SGA原本是用來進(jìn)行高通量合成致死型分析的，在這里被用來篩選雙基因缺失株(圖3)。靶菌株ssk2::natMX4是MATα型的，而帶有kanMX4標(biāo)簽的SGA陣列菌株是MATa型的，它們在YPD培養(yǎng)基上進(jìn)行雜交，產(chǎn)生MATα/a型的雙倍體菌株，同時(shí)帶有kanMX4和natMX4這2個(gè)遺傳標(biāo)簽。雙倍體菌株在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上生成四分孢子，孢子有MATa和MATα兩種交配型。MFA1pr-HIS3報(bào)告子只在MATa型的細(xì)胞中才能表達(dá)，所以在SD-HIS的培養(yǎng)基上就能夠篩選出MATa型的單倍體孢子。此外，CAN1基因編碼一種高親和性通透酶，刀豆氨酸和精氨酸都是通過這種通透酶進(jìn)入細(xì)胞的。因?yàn)榈抖拱彼崾蔷彼岬念愃莆�，對�?xì)胞具有毒害作用，所以在缺少精氨酸的SD+刀豆氨酸(L-Canavanine)的培養(yǎng)基中，含有CAN1基因的菌株是致死的，因?yàn)樗鼈償z取了刀豆氨酸，刀豆氨酸會代替精氨酸合成蛋白質(zhì)，由于結(jié)構(gòu)的不同導(dǎo)致蛋白功能出現(xiàn)異常，致使細(xì)胞死亡。因此，利用SD-His-Arg+L-Canavanine培養(yǎng)基就能夠篩選出不含有親本的MATa型單倍體孢子。最后利用YPD+G418+NAT培養(yǎng)基篩選出MATa型中的ssk2::natMX4xxx::kanMX4雙基因缺失株(圖4)。圖3合成遺傳陣列(SGA)方法［16］Fig．3Syntheticg
【作者單位】： 江南大學(xué)生物工程學(xué)院糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81371784) 江南大學(xué)自主研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(JUSRP51313B)
【分類號】：Q933

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄧紅梅;利用原生質(zhì)體融合提高釀酒酵母賴氨酸含量的研究[J];貴州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2002年03期

2 趙慧;鄭文嶺;高洋;張進(jìn)芳;彭翼飛;張寶;馬文麗;;狂犬病病毒糖蛋白在釀酒酵母中的表達(dá)[J];微生物學(xué)通報(bào);2009年11期

3 何煒,袁漢英,高卜渝,陳向嶺,李育陽;人類超氧化物歧化酶在釀酒酵母系統(tǒng)中的高效表達(dá)[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2004年02期

4 秦麗娜;江賢章;田寶玉;舒正玉;黃建忠;;代謝工程在釀酒酵母茵育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2007年12期

5 楊瑞娟;吳雪昌;;釀酒酵母體內(nèi)氮的代謝作用[J];農(nóng)機(jī)化研究;2008年01期

6 宮莉;裴軼琨;李曉玲;;從橢圓釀酒酵母中提取核酸[J];長春工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年05期

7 劉哲;詹良靜;張新宜;王欣榮;;高產(chǎn)谷胱甘肽釀酒酵母的選育及發(fā)酵工藝的研究[J];微生物學(xué)雜志;2013年01期

8 曾云中,吳雪昌,朱曉平,陳士怡;耐高溫釀酒酵母的選育 Ⅰ出發(fā)菌株的選擇及發(fā)酵特性分析[J];杭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1991年04期

9 鮑曉明,高東,曲音波,王祖農(nóng);木糖代謝基因表達(dá)水平對釀酒酵母重組菌株產(chǎn)物形成的影響[J];生物工程學(xué)報(bào);1997年04期

10 宋安東,吳坤,陳紅歌,常國林,王爽;釀酒酵母220菌株對鉛的生物吸附研究[J];微生物學(xué)通報(bào);2004年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 周峻崗;祁慶生;王鵬;;釀酒酵母糖基化過程基因工程改造[A];中國資源生物技術(shù)與糖工程學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2005年

2 楊繼旺;李琳;黃耀熊;;釀酒酵母生長過程中活性變化的熒光分析[A];中國遺傳學(xué)會“第十一屆全國激光生物學(xué)學(xué)術(shù)會議”暨《激光生物學(xué)報(bào)》創(chuàng)刊廿周年慶祝會、第十屆粵港生物物理研討會暨2012年廣東生物物理學(xué)術(shù)年會會議資料[C];2012年

3 張梁;石貴陽;王正祥;章克昌;;具有纖維二糖代謝途徑的重組釀酒酵母的構(gòu)建[A];中國資源生物技術(shù)與糖工程學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2005年

4 陳曉峰;江賢章;吳松剛;黃建忠;;脂肪酸碳鏈延長酶與脫飽和酶在釀酒酵母中共表達(dá)[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2010年學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2010年

5 李生強(qiáng);林琳;;擴(kuò)展青霉脂肪酶基因在釀酒酵母中的表達(dá)[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會2006年學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2006年

6 曹丹燕;劉欣;許琳;嚴(yán)明;;釀酒酵母醛糖還原酶的表達(dá)條件優(yōu)化及純化[A];第三屆全國化學(xué)工程與生物化工年會論文摘要集（上）[C];2006年

7 王慶杰;祁慶生;王鵬;;釀酒酵母表面表達(dá)蔗糖合成酶[A];中國資源生物技術(shù)與糖工程學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2005年

8 何才姑;江澍;樸英杰;;人自噬基因hATG12在釀酒酵母自噬過程中的作用[A];2007年中國解剖學(xué)會第十屆全國組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2007年

9 龔婷;何飛;廖媛;高向東;;釀酒酵母Rho4 GTP酶調(diào)控機(jī)制的研究[A];2012年第五屆全國微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2012年

10 鮑曉明;付加芳;陳蕾;王明鵬;;釀酒酵母脅迫轉(zhuǎn)錄因子Bdflp的功能研究[A];泛環(huán)渤海地區(qū)九省市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會——2011年學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前4條

1 劉霞;計(jì)算機(jī)可操控酵母菌內(nèi)特定基因開關(guān)[N];科技日報(bào);2011年

2 治;釀酒酵母部分蛋白組圖譜公布[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2002年

3 本報(bào)記者 李清理;堅(jiān)持走科技創(chuàng)新之路[N];中國證券報(bào);2000年

4 于佳淼 李成群;安琪超級釀酒酵母及其應(yīng)用技術(shù)[N];中國食品質(zhì)量報(bào);2005年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王路雯;Spt15及轉(zhuǎn)錄本UTR重疊對釀酒酵母基因表達(dá)的調(diào)控研究[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

2 呂小妹;利用代謝工程改造大腸桿菌及釀酒酵母進(jìn)行異戊二烯生物合成的基礎(chǔ)研究[D];浙江大學(xué);2015年

3 謝文平;代謝工程改造釀酒酵母生物合成類胡蘿卜素的研究[D];浙江大學(xué);2015年

4 王付轉(zhuǎn);絮凝性釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵[D];江南大學(xué);2008年

5 李莉莉;釀酒酵母耐性機(jī)理的代謝組學(xué)研究[D];華南理工大學(xué);2010年

6 張麗琳;釀酒酵母應(yīng)對鎘脅迫的分子機(jī)理研究[D];天津大學(xué);2012年

7 劉增然;利用淀粉的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建[D];四川大學(xué);2004年

8 趙經(jīng)文;釀酒酵母耐鋰鹽的分子機(jī)理研究[D];天津大學(xué);2014年

9 武志強(qiáng);穩(wěn)定表達(dá)長效胰高血糖素樣肽-1重組釀酒酵母的構(gòu)建及其應(yīng)用研究[D];南開大學(xué);2009年

10 胡蕓;釀酒酵母高親和力cAMP磷酸二酯酶Pde2p的功能研究[D];天津大學(xué);2010年

，

本文編號：2516118