發(fā)布時(shí)間：2019-07-14 20:23

【摘要】：山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是重要的木本油料作物,生產(chǎn)中易受到自然逆境脅迫因素影響,尤其是高溫,高溫下嚴(yán)重限制植物光合作用致使山核桃生長(zhǎng),結(jié)實(shí),有機(jī)物積累等都受到影響。因此,對(duì)山核桃光合作用相關(guān)基因的開發(fā)和利用具有重要的意義。在高等植物中光合作用關(guān)鍵步驟固定CO2過程需要Rubisco酶的催化,Rubisco酶的活性由植物體內(nèi)復(fù)雜的機(jī)制進(jìn)行調(diào)控,其中大量研究已證實(shí)Rubisco activase(RCA)能夠活化并維持Rubisco酶的催化活性。同時(shí)RCA也被認(rèn)為是植物在各種不同環(huán)境脅迫下對(duì)光合作用的關(guān)鍵調(diào)控因素。因此,Rubisco活化酶的功能研究對(duì)于增強(qiáng)植物體內(nèi)Rubisco酶活性穩(wěn)定光合作用系統(tǒng),進(jìn)而提高植物適應(yīng)逆境的能力具有重要作用。本試驗(yàn)通過應(yīng)用RACE技術(shù),克隆得到了山核桃2個(gè)RCA基因的全長(zhǎng)cDNA序列,命名為CcRCAα和CcRCAβ。序列開放閱讀框長(zhǎng)度分別為1419bp、1302bp,推測(cè)編碼472和433個(gè)氨基酸。利用DNAMAN軟件對(duì)山核桃RCA基因與葡萄等物種的RCA氨基酸序列進(jìn)行的多重序列比對(duì),結(jié)果表明,兩者氨基酸序列相似性很高,且與葡萄等物種的RCA序列同源性高達(dá)87%以上。本試驗(yàn)還得到了山核桃另一個(gè)RCA基因cDNA序列,命名為CcRCAβ2,分析表明,其氨基酸序列與CcRCAβ的相似性高達(dá)96%以上,同屬于β類型RCA基因。此外,本文以pET28a+載體為表達(dá)載體,構(gòu)建了載有山核桃CcRCAα的原核表達(dá)載體,通過IPTG法誘導(dǎo)BL21(DE3)表達(dá)菌株表達(dá)具有可溶性的RCA異源蛋白,并經(jīng)條件優(yōu)化得到原核表達(dá)的最適條件:培養(yǎng)基體積20ml中加入終濃度1mM的IPTG經(jīng)28℃誘導(dǎo)4-6小時(shí)。為進(jìn)一步研究山核桃RCA基因的功能奠定了基礎(chǔ)。本文還對(duì)山核桃RCA基因在高溫脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,高溫下山核桃光合速率、Rubisco酶活力及RCA基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平呈下降趨勢(shì),高溫抑制山核桃光合作用,可能通過影響RCA基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯進(jìn)而導(dǎo)致RCA酶含量的變化。深入研究發(fā)現(xiàn)嫁接山核桃對(duì)高溫脅迫的抵御能力高于未嫁接山核桃,H-L嫁接(湖南山核桃為砧木)的光合速率和Rubisco酶活在41℃時(shí)下降幅度最小分別為12.8%和19.9%較其他品種抗高溫性能更好,除了砧木因素外M-L嫁接(美國(guó)山核桃為砧木)較好的抗高溫性還可能與CcRCAβ2基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。以上結(jié)果說明山核桃RCA基因在高溫脅迫中發(fā)揮了重要的作用,為進(jìn)一步研究RCA基因與植物抗逆性的關(guān)系提供依據(jù)。
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圖片說明： s.ucl.ac.uk/psipred/），進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利ww.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的ver（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）程序，cTP）；采用 PSORT（http://www.psort.org/）程序， ClustalX2.1 進(jìn)行蛋白同源序列比對(duì)；采用 MEGA對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。析葉片總 RNA 的提取B 法聯(lián)合 Trizol 法提取山核桃葉片的總 RNA，，經(jīng) 泳結(jié)果顯示：有 28S、18S 和 5S 三條清晰泳帶 NanoPhotometer 測(cè)得 260nm 和 280nm 波長(zhǎng)處的吸280nm 比值介于 1.8-2.0 之間。同時(shí)電泳結(jié)果也表明
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圖片說明： 2.2 內(nèi)參β-actin 檢驗(yàn) cDNA(M:DL2000 marker;1: β-actinphoresis map of cDNAband for house-keeping gene β-actin.β-actin band)化酶基因中間片段獲取RNA 反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 第一條鏈為模板，根據(jù)比對(duì)，結(jié)合部分山核桃轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)的特異性T-PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢存在一清晰的泳帶。該泳帶的大小與預(yù)測(cè)片段大片段。PCR 產(chǎn)物凝膠回收后克隆到 PMD-vector1通過 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù) BLASTn，表明其與其他物
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S664.1

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本文編號(hào)：2514498