【摘要】：植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)廣泛存在于發(fā)酵的蔬菜和果汁中,在食品、飼料及醫(yī)療保健等領域受到高度關注。植物乳桿菌作為人體胃腸道中重要的益生菌群,為了有效發(fā)揮益生功能,必須耐受胃液中的極端酸性環(huán)境,以較高的存活率抵達人體腸道中。因此,乳酸菌的耐酸性成為選擇益生菌的標準之一。本研究以植物乳桿菌ZDY 2013為實驗菌株,植物乳桿菌ATCC 8014為對照菌株,利用生理生化測定的研究方法,分析比較兩株植物乳桿菌在酸性環(huán)境中的生理耐受現(xiàn)象,探討其機制。此外,借助基因工程的方法,構建谷氨酸脫氫酶原核表達載體,闡釋谷氨酸脫氫酶對提高工程菌耐酸性能的作用,從而為提升植物乳桿菌抵御酸脅迫的能力提供有效策略。主要研究結果如下:1、從細胞生理學水平比較植物乳桿菌ZDY 2013和ATCC 8014在酸應激中的生理變化。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),兩株植物乳桿菌酸處理后均出現(xiàn)形態(tài)結構的變化,其中植物乳桿菌ZDY 2013在酸性環(huán)境中可以更好地維持細胞形態(tài)和細胞膜完整性,緩解酸應激對細胞產(chǎn)生的損傷。對植物乳桿菌胞內pH值測定結果表明,植物乳桿菌ZDY 2013在酸性環(huán)境中較ATCC 8014保持更高的胞內pH值。此外,植物乳桿菌ZDY 2013的Na+,K+-ATPase活性和胞內ATP含量在酸性環(huán)境中分別比ATCC 8014高出35%和41%。植物乳桿菌胞內氨基酸含量測定結果表明,植物乳桿菌ZDY 2013在酸環(huán)境中具有更高的胞內精氨酸、谷氨酸、丙氨酸和組氨酸含量。精氨酸脫亞胺酶和谷氨酸脫羧酶酶活測定結果表明,植物乳桿菌ZDY 2013在酸性環(huán)境中的精氨酸脫亞胺酶和谷氨酸脫羧酶活力分別是ATCC 8014的1.2和1.3倍。2、以植物乳桿菌ZDY 2013基因組DNA為模板,PCR擴增谷氨酸脫氫酶基因,連接到表達載體pET-32a(+)上,重組質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導表達和鎳柱親和層析后獲得目的蛋白,活性測定顯示該蛋白具有谷氨酸脫氫酶的活性。同時,對表達菌株的酸耐受性測定結果表明,工程菌株在pH 4.5的存活率提高1.4倍。
[Abstract]:Lactobacillus botanica (Lactobacillus plantarum) is widely found in fermented vegetables and juices, and has attracted much attention in the fields of food, feed and health care. Lactobacillus botanica is an important probiotics group in human gastrointestinal tract. In order to play its probiotics function effectively, it is necessary to tolerate the extreme acidic environment in the gastric juice and reach the human intestinal tract with a higher survival rate. Therefore, acid tolerance of lactic acid bacteria has become one of the criteria for selection of probiotics. In this study, Lactobacillus botanica ZDY 2013 was used as the experimental strain and Lactobacillus botanica ATCC 8014 as the control strain. The physiological tolerance of two Lactobacillus botanica strains in acidic environment was analyzed and compared by means of physiological and biochemical methods, and the mechanism was discussed. In addition, the prokaryotic expression vector of glutamic dehydrogenase was constructed by means of genetic engineering, and the effect of glutamic dehydrogenase on improving acid tolerance of engineering bacteria was explained, thus providing an effective strategy for enhancing the ability of Lactobacillus botanica to resist acid stress. The main results are as follows: 1. The physiological changes of Lactobacillus botanica ZDY 2013 and ATCC 8014 in acid stress were compared in terms of cell physiology. Scanning electron microscopy (SEM) showed that the morphological and structural changes of two strains of Lactobacillus were observed after treatment with Lactobacillus acid, in which Lactobacillus botanica ZDY 2013 could maintain cell morphology and cell membrane integrity better in acidic environment. Relieves cell damage caused by acid stress. The results of intracellular pH measurement of Lactobacillus botanica showed that Lactobacillus botanica ZDY 2013 maintained a higher intracellular pH value than that of ATCC 8014 in acidic environment. In addition, the Na, K-ATPase activity and intracellular ATP content of Lactobacillus botanica ZDY 2013 in acidic environment were 35% and 41% higher than those of ATCC 8014, respectively. The results showed that Lactobacillus botanica ZDY 2013 had higher intracellular arginine, glutamic acid, alanine and histidine contents in acid environment. The activity of arginine decarboxylase and glutamic acid decarboxylase of Lactobacillus botanica ZDY 2013 in acidic environment was 1.2 and 1.32 times higher than that of ATCC 8014, respectively, the activity of arginine decarboxylase and glutamic acid decarboxylase of Lactobacillus botanica was 1.2 and 1.32 times higher than that of ATCC 8014, respectively. Glutamic acid dehydrogenase gene was amplified by PCR using genomic DNA of Lactobacillus botanica ZDY 2013 as template, and was ligated into expression vector pET-32a (). The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3). The target protein was obtained by IPTG induced expression and Ni column affinity chromatography. The activity analysis showed that the protein had the activity of glutamic acid dehydrogenase. At the same time, the acid tolerance test of the expressed strain showed that the survival rate of the engineering strain in pH 4.5 was increased by 1.4 times.
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q93;Q78

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