【摘要】：隨著全球變暖日益加劇的影響,高溫脅迫已經(jīng)成為限制植物分布和產(chǎn)量的重要因素。高溫脅迫影響植物的一系列生理和生化反應(yīng),包括氣孔關(guān)閉,水分散失,光合作用的抑制,活性氧積累,增加膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度,蛋白質(zhì)降解和酶活性喪失,最終導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞損傷,甚至細(xì)胞死亡。番茄是喜溫蔬菜,但不耐高溫,夏秋季局部地區(qū)出現(xiàn)的異常高溫嚴(yán)重抑制番茄的生長(zhǎng)發(fā)育,如何緩解高溫脅迫已成為當(dāng)務(wù)之急。因此,探討番茄耐高溫機(jī)理及其分子機(jī)制,具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的也是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫和激素應(yīng)答中均發(fā)揮重要作用。通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)番茄基因組進(jìn)行分析,從番茄中分離得到約102個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子,但其中大部分的功能尚未得到研究。本研究從番茄基因組中分離得到了一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子(Sl JA2),并以過(guò)表達(dá)Sl JA2的轉(zhuǎn)基因煙草為材料,觀察了高溫脅迫下植株的生長(zhǎng)狀況,研究了Sl JA2對(duì)煙草高溫抗性的影響。主要研究結(jié)果如下:(1)根據(jù)NCBI已知的Sl JA2基因序列(注冊(cè)號(hào):NM_001247043)利用DNAMAN 6.0設(shè)計(jì)特異引物,以番茄c DNA為模板,利用PCR反應(yīng)獲得該基因的全長(zhǎng)c DNA。Sl JA2基因全長(zhǎng)1567bp,開(kāi)放閱讀框1050bp,編碼349個(gè)氨基酸。(2)在煙草中瞬時(shí)表達(dá)p1300-Sl JA2-GFP融合蛋白產(chǎn)物,并利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)綠色熒光只存在于細(xì)胞核中,說(shuō)明Sl JA2定位于細(xì)胞核;利用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)Sl JA2的轉(zhuǎn)錄激活活性,發(fā)現(xiàn)其C端具有轉(zhuǎn)錄激活活性,是轉(zhuǎn)錄激活區(qū),說(shuō)明Sl JA2可能作為轉(zhuǎn)錄因子行使功能。(3)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q RT-PCR)對(duì)Sl JA2在番茄中的表達(dá)模式進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)受4°C、42°C、ABA、SA、PEG和MV等多種脅迫和激素處理的誘導(dǎo)表達(dá);組織特異性表達(dá)分析和GUS組織化學(xué)分析結(jié)果表明Sl JA2基因在葉及莖中表達(dá)量最高。(4)構(gòu)建p BI121-Sl JA2真核表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草,獲得過(guò)表達(dá)Sl JA2的轉(zhuǎn)基因煙草,利用PCR、q RT-PCR篩選得到轉(zhuǎn)基因煙草,并選取OE-5、OE-7和OE-18三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(5)室溫條件下,野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)狀況沒(méi)有明顯差別。高溫脅迫后,野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)都受到抑制,但是轉(zhuǎn)基因植株要比野生型煙草萎蔫的更加嚴(yán)重;轉(zhuǎn)基因煙草具有更低的種子萌發(fā)率及鮮重、較高的氣孔開(kāi)度和水分散失率,導(dǎo)致更嚴(yán)重的萎蔫。高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草水楊酸的含量下降,水楊酸合成基因下調(diào)而降解基因上調(diào);轉(zhuǎn)基因煙草脫落酸的含量上調(diào),脫落酸合成相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)。外源施加水楊酸和脫落酸都能延遲和緩解轉(zhuǎn)基因煙草高溫脅迫下的萎蔫。(6)高溫脅迫后,煙草植株的Pn、Fv/Fm和D1蛋白的水平降低,并且轉(zhuǎn)基因植株降低的幅度要比野生型煙草的大;同時(shí)煙草植株葉綠素含量降低,并且轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量更低。(7)高溫脅迫下,煙草的H_2O_2和O_2~(·-)的含量明顯增加,轉(zhuǎn)基因煙草H_2O_2和O2·-的積累高于野生型煙草,煙草植株抗氧化酶如過(guò)氧化氫酶(CAT)以及抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)的活性都降低,但是與轉(zhuǎn)基因植株相比,野生型煙草植株維持相對(duì)較高的抗氧化酶活性。同時(shí),對(duì)抗氧化酶合成相關(guān)基因(Nt CAT、Nt APX)的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)顯示,轉(zhuǎn)基因植物中的抗氧化酶基因的表達(dá)量低于野生型植株。高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的MDA含量和REL水平明顯高于野生型,說(shuō)明其細(xì)胞膜受傷害程度較重;高溫脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草中高溫響應(yīng)基因和脯氨酸合成基因等脅迫響應(yīng)相關(guān)基因上調(diào)程度明顯低于野生型。同時(shí),轉(zhuǎn)基因煙草中脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加,但增加量明顯低于野生型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2464466