【摘要】：以康寧木霉AS3.2774 m RNA為模板,通過RT-PCR技術,擴增了1 413 bp的CBHⅡ全長基因,利用T-A克隆,將CBHⅡ克隆至克隆載體p MD18-T Simple Vector,構建質(zhì)粒p MD18-T-CBHⅡ。以Sma I和Sph I雙酶切p MD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thy A)為選擇壓力的非抗生素抗性的穿梭表達載體p W425t,將純化的CBHⅡ亞克隆到p W425t中,得到原核表達重組質(zhì)粒p W425t-CBHⅡ,可在乳酸菌與大腸桿菌之間穿梭表達。將p W425t-CBHⅡ轉(zhuǎn)化在thy A基因缺陷型的大腸桿菌感受態(tài)E.coli X13中,通過質(zhì)粒提取、PCR鑒定、酶切鑒定、分析測序以及生長功能彌補篩選陽性克隆。SDS-PAGE分析,約49.6 k D的蛋白可見,剛果紅染色顯示重組大腸桿菌可產(chǎn)生明顯的水解圈,并用p NPC法測得重組大腸桿菌的CBHⅡ酶活力在溫度50℃、p H值5.0時達到最大。
[Abstract]:The full-length CBH 鈪，

本文編號：2450636