【摘要】：黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物,對(duì)于植物的自身防御和生理調(diào)節(jié)具有重要的作用。黃酮類(lèi)化合物還具有抗氧化、抑菌消炎、抑制腫瘤細(xì)胞活性、抗HIV活性等功能,且毒性較小,藥用價(jià)值較高。種子植物中黃酮代謝途徑已研究的較為透徹,作為黃酮含量較高的蕨類(lèi)植物,其黃酮代謝途徑尚不清楚。查爾酮異構(gòu)酶(CHI)是黃酮代謝途徑的關(guān)鍵限速酶之一,其主要功能為催化柚皮素查爾酮轉(zhuǎn)化為柚皮素,生成的柚皮素是后續(xù)多條代謝通路的前體物質(zhì),種子植物中的CHI基因?qū)儆诓闋柾悩?gòu)酶基因家族,分為T(mén)ypeΙ、TypeⅡ、TypeⅢ、TypeⅣ四個(gè)類(lèi)型,具有不同的生物學(xué)功能。然而,蕨類(lèi)植物中CHI基因的結(jié)構(gòu)特征、類(lèi)型及其功能尚不清楚,研究蕨類(lèi)植物中CHI基因,對(duì)闡明黃酮代謝途徑的分子機(jī)制,揭示CHI基因的功能及其演化均具有重要的科學(xué)意義。本研究以紅蓋鱗毛蕨為實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、PCR及高效液相色譜技術(shù)對(duì)查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)進(jìn)行克隆及表達(dá)分析,并對(duì)該基因序列的結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白功能等方面做了生物信息學(xué)分析。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要有以下幾個(gè)方面:1.利用Ilumina Hiseq 2000平臺(tái)對(duì)紅蓋鱗毛蕨拳卷葉進(jìn)行測(cè)序,獲得8.5G數(shù)據(jù)量。對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝拼接,共獲得Unigene 143604條。依據(jù)注釋結(jié)果分析獲得CHI可能性基因6條,經(jīng)分析選取其中3條作為CHI的候選基因。2.利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),成功克隆到三條基因的ORF序列,將三條基因序列重新命名為:DeCHI1、DeCHI2和DeCHI3。生物信息學(xué)分析表明,DeCHI1的ORF全長(zhǎng)651bp,編碼216個(gè)氨基酸;DeCHI2的ORF全長(zhǎng)822bp,編碼273個(gè)氨基酸;DeCHI3的ORF全長(zhǎng)738bp,編碼245個(gè)氨基酸。聚類(lèi)分析表明,DeCHI1與TypeΙ和TypeⅡ呈并列關(guān)系;DeCHI2屬于Type IV型;DeCHI3屬于Type III型。3.本研究成功構(gòu)建3條CHI的重組質(zhì)粒pET32a-DeCHI1、pET32a-DeCHI2、pET32a-DeCHI3,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到BL21感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建原核表達(dá)載體,并用IPTG誘導(dǎo)獲得融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE鑒定獲得蛋白大小分別為39.7kDa、45.0kDa、43.1kDa,與預(yù)期的蛋白大小相一致。4.本研究以柚皮素查爾酮和異甘草素為底物,分別采用3條基因純化后的融合蛋白對(duì)底物進(jìn)行催化,催化產(chǎn)物上高效液相色譜(HPLC)檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果表明:(1)DeCHI1、DeCHI2和DeCHI3的蛋白酶均能催化柚皮素查爾酮轉(zhuǎn)化為柚皮素,同時(shí)也能催化異甘草素轉(zhuǎn)化為甘草素,與目前報(bào)道的種子植物Type III CHI和Type IV CHI蛋白酶沒(méi)有催化活性不同;(2)DeCHI1不僅能催化柚皮素查爾酮,還能催化異甘草素轉(zhuǎn)化為甘草素,與現(xiàn)有報(bào)道僅豆科植物TypeⅡ可催化異甘草素的結(jié)論不同,進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)分析結(jié)果顯示DeCHI1與種子植物的TypeⅠ和TypeⅡ在同一簇中,推測(cè)其具有TypeⅠ和TypeⅡ的功能,推測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符;(3)在DeCHI1、DeCHI2和DeCHI3的蛋白酶催化柚皮素查爾酮轉(zhuǎn)化為柚皮素的過(guò)程中推測(cè)可能有中間產(chǎn)物產(chǎn)生,產(chǎn)物的具體成分有待進(jìn)一步研究。綜上所述,紅蓋鱗毛蕨具有不同類(lèi)型的CHI基因,但其功能尚未產(chǎn)生明顯的分化,它們產(chǎn)生的酶均能夠催化柚皮素查爾酮轉(zhuǎn)化為柚皮素,同時(shí)也能催化異甘草素轉(zhuǎn)化為甘草素,這反映了蕨類(lèi)植物黃酮類(lèi)次生代謝途徑較為原始的特點(diǎn)。
[Abstract]:Flavonoids are a kind of secondary metabolites which are widely present in the plants, which play an important role in the self-defense and physiological regulation of the plants. The flavonoid compound has the functions of resisting oxidation, inhibiting bacteria and diminishing inflammation, inhibiting tumor cell activity, resisting HIV activity and the like, and has small toxicity and high medicinal value. The metabolic pathway of the flavonoids in the seed plants has been studied thoroughly. As the high-content ferns, the metabolic pathway of the flavone is not clear. The chalcone isomerase (CHI) is one of the key speed-limiting enzymes of the flavone metabolic pathway, It is divided into four types: Type 鈪，

本文編號(hào)：2448499