【摘要】：棉花是全球性的重要經(jīng)濟(jì)作物,棉纖維是紡織工業(yè)最主要的天然纖維來(lái)源,棉纖維質(zhì)量和產(chǎn)量是棉紡織產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的有效動(dòng)力,棉紡織品的質(zhì)量和收益與棉纖維品質(zhì)有密不可分的關(guān)系。如何提高棉纖維品質(zhì)是棉花育種要解決的一個(gè)重要問(wèn)題。棉纖維品質(zhì)是在棉纖維發(fā)育的過(guò)程中形成的,研究發(fā)現(xiàn),在棉纖維的發(fā)育過(guò)程中存在苯丙烷代謝途徑,是纖維中僅次于纖維素代謝的第二大代謝途徑,該途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可能對(duì)棉纖維的發(fā)育與品質(zhì)形成具有重要影響,因此,對(duì)該途徑關(guān)鍵基因克隆及其分子機(jī)制研究,將為明確纖維品質(zhì)形成機(jī)制及利用基因工程手段改良棉纖維的品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。PIP亞家族基因編碼的蛋白是苯丙烷代謝中木脂素、黃酮、異黃酮類等次生代謝產(chǎn)物合成的重要酶,其中苯基香豆?jié)M芐基醚還原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase,PCBER)是苯丙烷代謝產(chǎn)物木脂素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶,PCBER基因在棉花的根、莖、葉、花、種皮和纖維中均有的表達(dá),那么在棉纖維的發(fā)育中發(fā)揮著什么樣的生物學(xué)功能?本研究以PCBER氨基酸序列為探針,利用生物信息學(xué)和分子克隆技術(shù)從棉纖維中克隆到6個(gè)PIP亞家族成員,研究PIP亞家族在棉花不同組織中的表達(dá)情況,同時(shí)將PIP亞家族成員GhPCBER1基因在擬南芥中異位表達(dá)和棉花中過(guò)量表達(dá),以期對(duì)該基因的功能進(jìn)行初步分析,結(jié)果如下:1.以PCBER氨基酸序列為探針,利用Blastp從陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)同源性較高的基因。根據(jù)6個(gè)基因序列設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR技術(shù)從陸地棉纖維細(xì)胞中克隆出了這6個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA序列,分別命名為GhPCBER1、GhPCBER2、GhPCBER3、GhIFR、GhPLR1和GhPLR2。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),6個(gè)基因編碼306~313個(gè)氨基酸,蛋白分子量為33 854.9~35 199.6 Da,蛋白的親水性較強(qiáng)且無(wú)信號(hào)肽,是非分泌蛋白,對(duì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)PIP蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中,6個(gè)蛋白均含有PIP類型蛋白的所有保守性基序和活性殘基,屬于PIP亞家族。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,6個(gè)PIP亞家族基因均在纖維發(fā)育次生壁合成期表達(dá)量較高,其中GhPCBER1在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá),根據(jù)基因的表達(dá)特征,推測(cè)其可能在棉纖維的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。2.構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-28a-GhPCBER1,酶切鑒定并測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。使用濃度為1 mmol/L的IPTG在不同時(shí)間梯度下誘導(dǎo),SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明,37℃誘導(dǎo)4h蛋白表達(dá)量最大,表達(dá)的蛋白相對(duì)分子量約為34.7k D,說(shuō)明pET-28a-GhPCBER1構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)成功,為下一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。3.為探究GhPCBER1的功能,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體,將過(guò)表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR驗(yàn)證,收獲抗性植株的種子,繼續(xù)用抗生素篩選,直至獲得純合體,提取擬南芥RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA后,進(jìn)行qPCR分析,選出GhPCBER1表達(dá)量高的株系,為后續(xù)研究做準(zhǔn)備。4.GhPCBER1基因過(guò)表達(dá)和RNAi抑制表達(dá)轉(zhuǎn)化陸地棉品種YZ-1,對(duì)侵染后的棉花下胚軸進(jìn)行組織培養(yǎng)和抗性篩選,得到胚性愈傷,進(jìn)一步誘導(dǎo)分化成幼苗,PCR驗(yàn)證后得到陽(yáng)性棉花植株,為今后進(jìn)一步研究GhPCBER1在棉花中的功能奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S562

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2446132