【摘要】：背景:DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾形式,是基因組DNA在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使Cp G二核苷酸5'端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'甲基胞嘧啶的反應(yīng)。DNA的甲基化在胚胎發(fā)育、維持正常細(xì)胞功能以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用,是目前最新的研究熱點之一。基因啟動子區(qū)域Cp G島胞嘧啶甲基化是抑制基因表達(dá)的重要途徑。傳統(tǒng)DNA甲基化研究方法中的亞硫酸氫鹽修飾后的克隆測序的方法操作繁瑣,價格昂貴。二代測序(The next generation sequencing,NGS)技術(shù)的出現(xiàn),極大得促進(jìn)了表觀遺傳學(xué)的研究。目的:GT1-7細(xì)胞是研究性發(fā)育的理想模型細(xì)胞,KISS1基因和Gn RH基因是性發(fā)育中兩個最重要的功能基因。查閱相關(guān)文獻(xiàn)表明該細(xì)胞中KISS1基因和Gn RH基因的啟動子甲基化的研究尚未見報道。本實驗使用亞硫酸氫鹽對GT1-7細(xì)胞和L929細(xì)胞基因組DNA修飾后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行二代測序。同時利用金標(biāo)準(zhǔn)的亞硫酸氫鹽修飾后克隆測序的方法作為對照,對相同批次的GT1-7細(xì)胞的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。對GT1-7細(xì)胞中KISS1基因和Gn RH基因啟動子范圍內(nèi)Cp G位點甲基化狀態(tài)進(jìn)行了研究。探索利用二代測序?qū)蜻x基因甲基化水平進(jìn)行檢測的技術(shù)。方法:利用RT-PCR和生物信息學(xué)在線軟件(PROMOTER2.0、Neural Network Promoter Prediction)確定KISS1基因轉(zhuǎn)錄本的類型,以及該轉(zhuǎn)錄本的啟動子序列;利用JASPAR對啟動子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析;利用試劑盒提取GT1-7細(xì)胞和L929細(xì)胞基因組DNA并進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理;利用Methyl-primer軟件設(shè)計亞硫酸氫鹽處理后測序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)引物,進(jìn)行巢式PCR;將巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行文庫構(gòu)建,上機(jī)二代測序。同時將相同批次純化的GT1-7細(xì)胞的PCR產(chǎn)物與p GM-T Fast載體連接及轉(zhuǎn)化,對克隆產(chǎn)物進(jìn)行菌落PCR的鑒定,對陽性克隆菌液進(jìn)行一代測序。結(jié)果:RT-PCR檢測,確定了GT1-7細(xì)胞中KISS1基因的轉(zhuǎn)錄本的類型是KISS1-002,本研究中以KISS1-002轉(zhuǎn)錄本為研究對象。PCR產(chǎn)物建庫二代測序結(jié)果表明,GT1-7細(xì)胞KISS1和Gn RH兩個基因啟動子區(qū)域中27個Cp G位點甲基化位點信息完整,KISS1基因啟動子區(qū)域內(nèi)(Cp G1-Cp G20)的平均甲基化水平為78.74%(Cp G位點甲基化水平最高為98.69%,最低為25.37%),Gn RH基因啟動子區(qū)域內(nèi)(Cp G1-Cp G7)平均甲基化水平為88.09%(Cp G位點甲基化水平最高為98.52%,最低為55.66%)。挑取10個陽性克隆進(jìn)行一代測序,序列無丟失,KISS1和Gn RH兩個基因27個Cp G甲基化位點信息完整,KISS1基因啟動子區(qū)域內(nèi)(Cp G1-Cp G20)的平均甲基化水平為79.00%(最高為100%,最低為20.00%),Gn RH基因啟動子區(qū)域內(nèi)(Cp G1-Cp G7)平均甲基化水平為84.28%(最高為100%,最低為60.00%)。L929細(xì)胞中二代測序結(jié)果表明,GT1-7細(xì)胞KISS1和Gn RH兩個基因啟動子區(qū)域中27個Cp G位點甲基化位點信息完整,KISS1基因啟動子區(qū)域內(nèi)(Cp G1-Cp G20)的平均甲基化水平為94.07%(Cp G位點甲基化水平最高為86.02%,最低為99.73%)。Gn RH基因啟動子區(qū)域內(nèi)(Cp G1-Cp G7)平均甲基化水平為97.32%(Cp G位點甲基化水平最高為98.57%,最低為95.32%)。結(jié)論:利用高通量的二代測序技術(shù)能夠有效的對DNA甲基化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測,二代測序和克隆測序都是研究DNA甲基化的有效方法,但前者與克隆測序相比每一個讀取序列(reads)都相當(dāng)于一個單克隆,二代測序使每個區(qū)段得到成千上百個reads,因此二代測序結(jié)果更加精確。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：2442320