【摘要】：目的:急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是一種臨床常見病,特別是藥物性急性腎損傷發(fā)病率更高,并有繼續(xù)升高的趨勢,且死亡率高,也是引起慢性腎臟疾病的主要原因之一。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,國外一般住院患者和危重患急性腎損傷發(fā)生率分別高達5%和20%~30%;我國入院患者急性腎損傷發(fā)生率為11.6%,其中40%急性腎損傷患者與藥物相關,這些都導致患者住院時間延長和治療費用增加。目前,對于急性腎損傷的診斷和治療方面仍然沒有特異性方法。發(fā)病機制方面,主要認為是藥物導致腎小管上皮細胞壞死后引起壞死性炎癥反應,輕度損傷時腎小管上皮細胞可通過再生達到完全性修復,持續(xù)損傷或損傷較重時出現(xiàn)以腎臟纖維化為主的不完全修復,最終出現(xiàn)慢性腎臟疾病。大量研究都證實,在整個壞死性炎癥反應、再生修復和纖維化過程中,MyD88分子作為TLRs/NF-κB通路最重要的轉(zhuǎn)接蛋白,參與了細胞壞死和炎癥反應;細胞再生、去分化和表型轉(zhuǎn)化;以及纖維化形成,而且都起到不可或缺的作用。然而,所有關于MyD88蛋白或基因的研究都是采用蛋白拮抗或基因敲除的方法,但由于腎臟功能和結(jié)構(gòu)的特殊性,腎臟細胞種類繁多,上述方法很難準確描述各類細胞在急性腎損傷發(fā)病機制中的作用。同時,考慮腎臟TECs是ATN和AKI發(fā)病機制中的最重要組織細胞之一,藥物相關性AKI早期最主要的病理改變就是ATN。因此,本課題旨在進一步明確腎小管內(nèi)MyD88基因?qū)λ幬镄訟KI腎臟功能和形態(tài)學的影響,以及對損傷、修復相關標記物的影響及其相關可能機制。并為AKI研究提供新思路,為MyD88成為藥物性AKI診斷和治療中的新靶點提供理論依據(jù)。方法:根據(jù)Cre/Lox P基因敲除技術原理,將MyD88基因外顯子3兩側(cè)加入Lox P酶切位點的轉(zhuǎn)基因小鼠與含腎小管特異性Cre重組酶啟動子的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,通過基因型檢測,保留特異性腎小管MyD88基因敲除(MyD88~(f/f) Ksp-Cre+)雄性小鼠。同時,明確腎小管上皮細胞內(nèi)MyD88基因敲除情況。小鼠6~8周齡時用于腹腔內(nèi)注射葉酸(250μg/g體重),建立穩(wěn)定的急性腎損傷小鼠模型。將實驗小鼠分為WT組和MyD88~(f/f) Ksp-Cre+組,分別留取葉酸注射前、注射后第2、7、14和28天的血、尿標本和腎臟標本,并檢測腎功能和病理學改變,以及腎臟損傷、修復相關的生物標記物改變情況,同時,通過細胞衰老β-半乳糖苷酶染色和流式細胞儀檢測FA注射后第2天細胞衰老情況。結(jié)果:1、MyD88~(f/f) Ksp-Cre+小鼠腎小管上皮細胞內(nèi)MyD88基因m RNA相對表達量較巨噬細胞和WT小鼠內(nèi)腎小管上皮細胞明顯降低,分別為0.041±0.027、0.156±0.003和0.153±0.043,且均差異有統(tǒng)計學意義。同樣,MyD88~(f/f) Ksp-Cre+小鼠腎小管上皮細胞內(nèi)MyD88蛋白相對表達量較巨噬細胞和WT小鼠內(nèi)腎小管上皮細胞明顯降低,分別為0.145±0.0498、0.737±0.190和0.685±0.083,且均有統(tǒng)計學意義。WT組FA-AKI死亡率較MyD88~(f/f) Ksp-Cre+組升高,兩者生存曲線經(jīng)Log rank檢驗后,P=0.091,無明顯統(tǒng)計學意義;2、WT組和MyD88~(f/f) Ksp-Cre+組血肌酐濃度在FA注射后第2天達高峰,分別為1.373±0.941 mg/d L和0.474±0.257 mg/d L,兩者差異有統(tǒng)計學意義。尿微量白蛋白與尿肌酐濃度比值(ACR)也在FA注射后第2天達高峰,分別為137.699±97.542mg/g和180.800±132.665mg/g,兩者差異無統(tǒng)計學意義;3、HE染色和PAS染色均顯示,WT-d28組小鼠腎小管上皮細胞損傷及刷狀緣缺失,以及炎癥細胞浸潤較MyD88~(f/f) Ksp-Cre+組嚴重程度更高。Masson’s Trichrome染色顯示,WT組和MyD88~(f/f) Ksp-Cre+組纖維化面積百分比(%)分別為10.380±7.195和4.169±4.489,兩者差異有統(tǒng)計學意義。檢測腎臟膠原蛋白占總蛋白含量比值分別為0.062±0.031和0.041±0.012,差異有統(tǒng)計學意義;4、免疫熒光法檢測WT-d28組和MyD88~(f/f)-d28組FA-AKI相關生物標記物,計數(shù)方法有標記物熒光面積占總面積百分比(%)或陽性細胞占總細胞數(shù)百分比(%),結(jié)果顯示,腎小管損傷標記物:NGAL分別為1.227±1.192和0.461±0.419;KIM-1分別為1.096±0.837和0.251±0.302;DNA損傷標記物γ-H2AX分別為0.444±0.694和0.692±0.495;細胞增殖標記物:Ki67分別為1.937±1.513和2.464±1.349;纖維化形成相關標記物:FSP1分別為3.276±2.320和2.290±1.573;CD68分別為3.926±2.054和2.284±1.041;α-SMA分別為0.963±0.749和0.601±0.457;F4/80分別為1.020±0.902和0.568±0.644;CD31分別為0.649±0.447和1.478±1.220,以上標記物在兩組間差異有統(tǒng)計學意義。而細胞凋亡檢測TUNEL分別為0.015±0.012和0.014±0.017;Caspase3分別為0.003±0.004和0.004±0.003;腎小管轉(zhuǎn)錄抑制標記物H3K9me3分別為45.361±35.506和55.844±29.633,此部分標記物差異性無統(tǒng)計學意義;5、WT-d28組和MyD88~(f/f)-d28組,KIM-1、NGAL、IL-1α和IL-8基因相對表達量差異有統(tǒng)計學意義,而MMP-3、IL-1β和IL-6差異無統(tǒng)計學意義;6、WT-d2組和MyD88~(f/f)-d2組衰老細胞百分比(%)分別為7.853±2.382和3.02±0.559,兩組差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論:1、可通過雜交MyD88~(f/f)小鼠與Ksp-Cre小鼠,獲得MyD88~(f/f) Ksp-Cre小鼠,以達到特異性敲除腎小管上皮細胞內(nèi)MyD88基因的目的;FA誘導AKI模型符合臨床病理過程,死亡率在可接受范圍,WT組和MyD88~(f/f) Ksp-Cre組小鼠生存曲線差異性符合實驗要求。2、特異性敲除腎小管MyD88基因有效改善腎臟功能和保護腎臟組織結(jié)構(gòu)完整性,并減輕組織損傷和降低纖維化程度,有利于AKI預后。3、特異性敲除腎小管MyD88基因可直接減輕腎小管損傷,促進細胞增殖,同時,通過減少炎癥因子表達、腎實質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化,以及減輕細胞衰老,以達到降低腎臟纖維化的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R692

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