【摘要】：山韭為百合科多年生的野生蔥屬植物,是中國(guó)傳統(tǒng)藥材,其有效的藥用成分具有抗病原微生物、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降血糖、抗血小板聚集以及護(hù)肝等生理學(xué)功能,而這藥用成分主要是蒜素。蒜素是通過蒜氨酸酶與蒜氨酸發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的有機(jī)硫化物之一,因此克隆及分析蒜氨酸酶基因,不僅為該酶的進(jìn)一步研究提供一定的理論依據(jù),同時(shí),為蒜素在醫(yī)藥領(lǐng)域的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。1本研究以山韭為實(shí)驗(yàn)材料,進(jìn)行山韭蒜氨酸酶(暫命名為AsALy1)基因cDNA序列的克隆、表達(dá)量分析以及生物信息學(xué)分析。具體研究方法:利用RT-PCR技術(shù)克隆AsALy1基因和山韭actin基因的保守區(qū)序列;利用RACE技術(shù)克隆As ALy1基因的3'/5'端未知序列和ORF序列,并通過電子拼接得到AsALy1基因的全長(zhǎng)cDNA序列;通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)AsALy1基因在山韭不同組織中表達(dá)量進(jìn)行分析;運(yùn)用生物信息學(xué)分析As ALy1基因的氨基酸序列。研究結(jié)果:克隆出的AsALy1基因保守區(qū)片段的長(zhǎng)度為862 bp;利用RACE技術(shù)獲得了長(zhǎng)度為1655 bp的AsALy1基因的全長(zhǎng)cDNA;利用生物信息軟件分析表明,其開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1440 bp,編碼479個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),相對(duì)分子質(zhì)量為54950.82 Da,理論等電點(diǎn)為8.75;預(yù)測(cè)As ALy1蛋白在13 32位氨基酸之間有個(gè)跨膜區(qū);二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、隨機(jī)卷曲和β折疊鏈組成;預(yù)測(cè)的蒜氨酸酶具有天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶超家族結(jié)構(gòu)域、C-末端的催化結(jié)構(gòu)域、類表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域以及天冬氨酸/蛋氨酸/酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)域;預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)具有絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸三種磷酸化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)�？寺〕龅纳骄耡ctin基因保守區(qū)片段的長(zhǎng)度為386 bp;經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)得出AsALy1基因在莖中的表達(dá)量分別是花、葉和種子的0.7倍、36倍和157倍,而AsALy1基因在根中幾乎不表達(dá),表明該酶是鱗莖蒜氨酸酶。
[Abstract]:Chinese chive is a perennial wild Allium plant of Liliaceae. It is a traditional Chinese medicine. Its effective medicinal ingredients are anti-pathogenic microorganism, anti-oxidation, anti-tumor, lowering blood pressure, lowering blood lipid, lowering blood sugar. Antiplatelet aggregation and liver protection and other physiological functions, and this medicinal ingredient is mainly allicin. Alliin is one of the organic sulfides produced by the reaction of alliinase with alliinic acid. Therefore, cloning and analyzing alliinase gene not only provides a theoretical basis for further study of alliinase, but also provides a theoretical basis for further study of alliinase. In this study, the cDNA sequence of alliinase gene (tentatively named AsALy1) was cloned, expressed and bioinformatics were analyzed. Methods: the conserved regions of AsALy1 gene and actin gene were cloned by RT-PCR. The unknown and ORF sequences of As ALy1 gene were cloned by RACE technique, and the full-length cDNA sequence of AsALy1 gene was obtained by electronic splicing, and the expression of AsALy1 gene in different tissues was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR technique. The amino acid sequence of As ALy1 gene was analyzed by bioinformatics. Results: the length of the conserved region of the cloned AsALy1 gene was 862 bp;. The full-length cDNA; of the AsALy1 gene with the length of 1655 bp was obtained by RACE technique. The analysis of bioinformatics software showed that the open reading frame (ORF) length was 1440 bp, and the relative molecular weight was 54950.82 Da, theoretical isoelectric point was 8.75; It is predicted that the As ALy1 protein has a transmembrane region between the amino acids of 13 and 32, and the secondary structure is mainly composed of 偽 helix, random crimp and 尾 -fold chain. The predicted alliinase has superfamily domain of aspartate aminotransferase, catalytic domain of C-terminal, epidermal growth factor domain and aspartate / methionine / tyrosine transaminase domain. It was predicted that the protein had three phosphorylation sites, serine, threonine and tyrosine, and N-glycosylation sites. The length of the conserved fragment of actin gene was 386 bp;. The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that the expression of AsALy1 gene in stem was 0.7 times, 36 times and 157 times as much as that in flower, leaf and seed, while AsALy1 gene was almost not expressed in root, which indicated that AsALy1 gene was alliinase in bulb.
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2;S567.239

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2428208