【摘要】：目的:構(gòu)建大鼠p300基因短發(fā)夾狀小干擾RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表達質(zhì)粒,觀察沉默p300基因?qū)喨芙庑?sublytic)C5b-9誘導大鼠腎小球系膜細胞(glomerular messangial cell,GMC)凋亡和激活轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcription factor 3,ATF3)乙�；降挠绊�。方法:用DNA重組技術(shù)針對p300基因不同位點設計3個shRNA序列,然后分別克隆到真核表達載體pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA中,經(jīng)電轉(zhuǎn)染入GMC,再給予sublytic C5b-9刺激。Western blot篩選干涉效果最佳的p300 shRNA,流式細胞術(shù)檢測GMC凋亡率,免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和Western blot聯(lián)合檢查ATF3乙�；健＝Y(jié)果:核酸測序表明p300 shRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。Western blot顯示p300 shRNA-2具有最佳沉默效率。p300 shRNA處理GMC后,由sublytic C5b-9誘導的GMC凋亡率顯著下降,同時ATF3乙酰化水平也明顯降低。結(jié)論:成功構(gòu)建了大鼠p300 shRNA真核表達質(zhì)粒,并初步證實了p300能夠促進sublytic C5b-9誘導的GMC凋亡,其機制可能與p300乙酰化修飾ATF3有關。
[Abstract]:Objective: to construct the eukaryotic expression plasmid of rat p300 gene short hairpin small interfering RNA (short hairpin RNA,shRNA and to observe the effect of silencing p300 gene on (glomerular messangial cell, of rat glomerular Mesangial cells induced by sublytic (sublytic) C5b-9. GMC) apoptosis and activation of transcription factor 3 (activating transcription factor 3 ATF 3) acetylation level. Methods: three shRNA sequences were designed for different sites of p300 gene by DNA recombination technique, and then were cloned into eukaryotic expression vector pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA and transfected into GMC, by electrotransfection. Then sublytic C5b-9 stimulated. Western blot was used to screen out the best interference effect. The apoptosis rate of GMC was detected by flow cytometry with p300 shRNA, and the ATF3 acetylation level was detected by combined immunoprecipitation (immunoprecipitation,IP) and Western blot. Results: nucleic acid sequencing showed that p300 shRNA-2 had the best silencing efficiency when the p300 shRNA recombinant plasmid was successfully constructed, the GMC apoptosis rate induced by sublytic C5b-9 was significantly decreased and the level of ATF3 acetylation was significantly decreased after GMC was treated with p300 shRNA. Conclusion: rat p300 shRNA eukaryotic expression plasmid was successfully constructed, and it was preliminarily confirmed that p300 can promote GMC apoptosis induced by sublytic C5b-9. The mechanism may be related to p300 acetylation modified ATF3.
【作者單位】： 南京醫(yī)科大學免疫學系;
【基金】：江蘇省高校自然科學研究面上項目(14KJB310006) 南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院優(yōu)勢學科教師培養(yǎng)基金(JX10131802/007)
【分類號】：R692

【參考文獻】

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本文編號：2416512