【摘要】：【目的】克隆滇龍膽香葉醇10-羥化酶基因Gr G10H(geraniol 10-hydroxylase),分析其生物信息學(xué)特征、基因結(jié)構(gòu)、蛋白表達(dá)和組織表達(dá)情況,為龍膽苦苷生物合成途徑解析提供理論依據(jù)。【方法】通過RT-PCR及基因克隆方法,從滇龍膽總RNA中克隆得到基因Gr G10H及其基因組序列;使用生物信息學(xué)方法分析其DNA序列及其編碼蛋白特性,使用Clustal X2.1軟件對Gr G10H蛋白質(zhì)及其同源序列做序列比對,使用MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建;利用定量PCR技術(shù)分析Gr G10H基因在滇龍膽根莖葉中的表達(dá)水平。【結(jié)果】使用RT-PCR方法從滇龍膽葉片中克隆得Gr G10H基因全長為1834 bp,包含2外顯子和1內(nèi)含子,ORF1548 bp,將序列提交至Gen Bank,得到序列號KJ418410。生物信息學(xué)分析表明,該基因編碼515個氨基酸,分子量為57.74 k D,理論等電點(diǎn)為9.02;該蛋白屬于細(xì)胞色素P450超家族成員,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),其N端含一跨膜螺旋(21~43),其中1~20氨基酸殘基位于膜內(nèi),44~515位于膜外。該蛋白無信號肽,為親水穩(wěn)定蛋白,主要由無規(guī)則卷曲(44.85%)和α-螺旋(40.58%)構(gòu)成。Gr G10H蛋白與川西獐牙菜Sm G10H蛋白具有較高的相似性(87%),且親緣關(guān)系最近。原核表達(dá)結(jié)果表明,Gr G10H基因在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白相對分子質(zhì)量約為83.74 k D(含GST標(biāo)簽26.00 k D),與預(yù)期蛋白大小一致。組織特異性表達(dá)分析結(jié)果表明Gr G10H基因主要在葉中表達(dá)。【結(jié)論】克隆到滇龍膽Gr G10H基因,并成功在大腸桿菌中表達(dá),推測其在主要葉片中起作用。
[Abstract]:[objective] to clone the gene Gr G10H (geraniol 10-hydroxylase) and analyze its bioinformatics characteristics, gene structure, protein expression and tissue expression. [methods] the gene Gr G10H and its genomic sequence were cloned from the total RNA of Gentiana by RT-PCR and gene cloning. The DNA sequence and its encoding protein were analyzed by bioinformatics method, the sequence alignment of Gr G10H protein and its homologous sequence was made by Clustal X2.1 software, and the phylogenetic tree was constructed by MEGA7.0 software. Quantitative PCR technique was used to analyze the expression of Gr G10H gene in the rhizome leaves of Gentiana yunnanensis. [results] the Gr G10H gene was cloned from the leaves of Dian Gentiana by RT-PCR method. The full length of Gr G10H gene was 1834 bp, with exon 2 and intron 1, ORF1548 bp,. Submit the sequence to the Gen Bank, to get the sequence number KJ418410. Bioinformatics analysis showed that the gene encodes 515 amino acids with molecular weight of 57.74 KD and theoretical isoelectric point of 9.02; The protein belongs to the cytochrome P450 superfamily and is located in the endoplasmic reticulum. The N-terminal of the protein contains a transmembrane helix (21 / 43), in which the 1o 20 amino acid residues are located in the membrane and 44 / 515 are located outside the membrane. The protein is a hydrophilic stable protein, which is composed of irregular curl (44.85%) and 偽 -helix (40.58%). The Gr G10H protein is similar to Sm G10H protein (87%). And the kinship is closest. The results of prokaryotic expression showed that the relative molecular weight of the recombinant protein expressed by Gr G10H in E. coli was about 83.74 k D (with GST tag 26.00 k D), and the expected protein size was the same. The results of tissue specific expression analysis showed that Gr G10H gene was mainly expressed in leaves. [conclusion] Gr G10H gene was cloned and successfully expressed in Escherichia coli.
【作者單位】： 玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院;云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所;
【基金】：云南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2015Z171) 云南省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(201511390005)
【分類號】：S567.239

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本文編號：2411239