【摘要】：變態(tài)發(fā)育是昆蟲發(fā)育中最具特色和最為重要的現(xiàn)象,也是昆蟲對外界環(huán)境長期適應(yīng)進(jìn)化的結(jié)果。根據(jù)發(fā)育過程中是否存在蛹期把昆蟲分為完全變態(tài)與不完全變態(tài)兩大類。完全變態(tài)昆蟲被認(rèn)為是昆蟲綱中進(jìn)化程度最高的一群,其一生要經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個階段。通常完全變態(tài)昆蟲的成蟲形態(tài)和大小是由蛹個體長度大小來決定的。然而,哪些因素影響了昆蟲蛹體長度的大小呢?已有的研究發(fā)現(xiàn)蛹體長度大小的形成涉及一系列的基因表達(dá)、網(wǎng)絡(luò)調(diào)控和激素調(diào)節(jié),其發(fā)育調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜。目前,人們對于這一機(jī)制的了解還只是冰山一角,特別是miRNA如何調(diào)控昆蟲蛹期發(fā)育更是知之甚少。miRNA是一類21～24nt的非編碼小RNA,其通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平發(fā)揮生物學(xué)功能。由于成熟miRNA的片段較短以及靶基因眾多等特點(diǎn)導(dǎo)致目前對miRNA確切的和多樣化的功能研究較為困難,因此利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)實驗相結(jié)合方法對miRNA調(diào)控昆蟲蛹體長度大小進(jìn)行深入研究,不僅對深刻揭示miRNA在昆蟲變態(tài)發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制具有重要的理論意義,而且對農(nóng)業(yè)昆蟲的防治也具有重要的實踐價值。黑腹果蠅是完全變態(tài)昆蟲同時也是經(jīng)典的模式生物,因此本論文選取黑腹果蠅為研究對象,對miRNA調(diào)控黑腹果蠅的蛹體長度大小進(jìn)行研究。分析黑腹果蠅miRNA的表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)miR-11在三齡幼蟲后期到預(yù)蛹期均出現(xiàn)表達(dá)量的增加,而在其它階段表達(dá)量較低。進(jìn)一步對miR-11所屬家族進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)miR-11只在完全變態(tài)昆蟲中保守,而不完全變態(tài)昆蟲中沒有發(fā)現(xiàn)miR-11的存在,這些結(jié)果暗示miR-11可能參與了黑腹果蠅蛹期發(fā)育調(diào)控。為了驗證這一假設(shè),論文進(jìn)行了以下研究:1.利用RMCE技術(shù)和Gal4/UAS系統(tǒng)構(gòu)建了 miR-11的敲除或缺失品系以及miR-11的過表達(dá)品系,并且對miR-11突變品系進(jìn)行表型觀察,發(fā)現(xiàn)miR-11的敲除或功能性缺失突變體品系會導(dǎo)致黑腹果蠅蛹體長度和重量均變大,而miR-11全身過表達(dá)品系則出現(xiàn)蛹期致死。對一齡幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲、蛹和成蟲五個不同發(fā)育階段表型觀察及體長測量排除了發(fā)育延遲導(dǎo)致蛹變長的可能,同時發(fā)現(xiàn)miR-11的敲除會導(dǎo)致蛹和雌雄成蟲的體長均出現(xiàn)增長,而幼蟲期的miR-11敲除品系與野生型相比沒有顯著性差異。敲除或者抑制miR-11活性能夠使黑腹果蠅在變態(tài)過程中形成體長較大的蛹,暗示miR-11可能參與了黑腹果蠅蛹體長度大小的調(diào)控。2.為了揭示miR-11調(diào)控黑腹果蠅的蛹體長大小的機(jī)制,利用生物信息學(xué)技術(shù)對miR-11的189個靶基因進(jìn)行信號通路富集性分析,發(fā)現(xiàn)這些靶基因主要涉及Ras/MAPK信號通路,并且miR-11能夠靶向Ras/MAPK通路中的Ras85D和Sos基因。進(jìn)一步對miR-11與Ras85D、Sos基因的靶標(biāo)關(guān)系進(jìn)行體內(nèi)和體外驗證,發(fā)現(xiàn)miR-11能夠作用Ras85D基因的3'UTR區(qū)域,而無法靶向Sos基因的3'UTR區(qū)域,表明miR-11可能是通過靶向Ras85D基因來調(diào)控蛹體長度大小。3.為了證明是否miR-11直接靶向Ras85D來調(diào)控蛹體長度大小的形成,對靶基因Ras85D在miR-11誘導(dǎo)的蛹缺陷表型中的作用進(jìn)行了研究。我們運(yùn)用基礎(chǔ)遺傳學(xué)方法構(gòu)建雙突變體:同時敲除miR-11和抑制的Ras85D的功能品系,發(fā)現(xiàn)雙突變株能夠挽救了 miR-11敲除株的表型缺陷。對Ras85D和miR-11的時間表達(dá)模式分析,發(fā)現(xiàn)miR-11和Ras85D的表達(dá)量在化蛹以后的呈現(xiàn)此消彼長表達(dá)模式。這些結(jié)果表明miR-11在整個變態(tài)發(fā)育過程中抑制Ras85D的表達(dá),并且通過直接靶向Ras85D調(diào)控蛹體長度大小的形成。綜上所述,我們利用生物信息學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)實驗的有效手段,證明了黑腹果蠅miR-11可以通過直接靶向Ras85D的3'UTR進(jìn)而調(diào)控蛹體長度大小的形成,最終參與了蛹期變態(tài)發(fā)育的調(diào)控。論文結(jié)果為miRNA調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育提供了有力的和切實的實驗證據(jù);為深入揭示昆蟲變態(tài)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供了新視角和有益的啟示;生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的手段能有效地發(fā)現(xiàn)miRNA的靶基因和功能,這為進(jìn)一步研究miRNA的潛在功能提供了新的研究策略;揭示miR-11調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育的機(jī)制將對于農(nóng)業(yè)害蟲防治也具有深遠(yuǎn)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q963

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本文編號：2409335