【摘要】：癲癇是一種多病因引起大腦皮層神經元異常超同步化放電,致使中樞神經系統(tǒng)短暫功能障礙的慢性疾病,是危害我國人民身心健康的常見疾病之一,年發(fā)病率在7.0‰左右。癲癇的發(fā)病人群主要分布在兒童及青少年,大多數(shù)患者經過一線抗癲癇藥物治療可以達到臨床緩解,但是仍有大約30%患者會發(fā)展為藥物難治性癲癇。據(jù)國內最新回顧性研究報道,我國接受難治性癲癇外科手術的患者中,腦皮質發(fā)育不良(malformations of cortical development, MCD)患者約占60%;其中小于3歲的兒童藥物難治性癲癇病患中,MCD所占比例幾近80%。因此,有效闡明MCD的病理發(fā)生及相關癲癇發(fā)生的分子學機制,對于難治性癲癇的早期診斷及個性化治療具有重要意義。MCD癲癇病灶均存在典型病理學改變,其共同特征包括大腦板層結構紊亂和灰白質交界不清。腦皮質發(fā)育不良亞型較多,其中臨床最常見的類型為局灶皮質發(fā)育不良(focal cortical dysplasia, FCDs)、頭小畸形(polymicrogyria)、結節(jié)性硬化癥(tuberous sclerosis complex, TSC)等。2011 年,國際抗癲癇聯(lián)盟(international league against epilepsy,ILAE)根據(jù)專家聯(lián)合討論,提出最新FCDs分類標準:根據(jù)病理及影像學表現(xiàn)可大體分為單純型與混合型。對于單純型FCDs,其包括FCDⅠ型和FCDⅡ型,病理表現(xiàn)為板層紊亂、皮白交界模糊(FCD Ⅰ,Ⅱ)及散布異形神經元(DNs)和氣球樣細胞(BCs) (FCDⅡ)。另一種常見MCD類型,TSC通常認為是一種常染色體顯性遺傳全身性疾病,其中樞神經系統(tǒng)病理改變與FCD Ⅱ型類似,特別是FCDⅡb型,包括板層結構消失、灰白質交界模糊、結節(jié)內散布大量DNs及巨大細胞(giant cells, GCs)。近年研究發(fā)現(xiàn),FCDs致癇機制十分復雜,涉及到眾多因素如離子通道異常、過度炎性反應及胞外基質成分異常等。至今學術界仍然沒有找到其主效致病因素,考慮到FCDs大多散發(fā)的分布特征,并且有報道顯示FCDs存在某些特征性基因突變,這強烈提示我們可能存在特定核苷酸突變導致該疾病的發(fā)生發(fā)展。深入探索FCDs疾病的主效致病基因,可能為FCDs患者的診斷和治療提供更多的幫助。更進一步,探索DNA改變引起的下游功能學改變更加重要,轉錄組高通量技術的興起,使得基因功能學研究更加高效便捷,可以為我們深入了解FCDs相關致病基因功能提供有力的支撐,將有助于人們進一步認識和闡明FCD的病理發(fā)生及致癇機制。目前針對MCD患者相關癲癇的治療,臨床常用抗癲癇藥物大多以選擇性離子通道為作用靶點,而針對非選擇性離子通道相關研究報道不多。近年來,學者更多地將研究焦點放在非選擇性離子通道家族(Transient receptor potential channels, TRP channels),該家族成員主要定位在細胞膜系統(tǒng)中,通過內源性及外源性物質活化,介導胞膜陽離子非選擇性通過。目前已發(fā)現(xiàn)的TRP通道主要包括TRPA、TRPC、TRPV及TRPM等7大類,共計30個離子通道。其中,TRPC通道作為TRP通道家族重要成員,廣泛表達于哺乳動物腦組織中,并且主要分布在神經元、膠質細胞及內皮細胞中。既往研究發(fā)現(xiàn),TRPC4可以通過Ca2+介導海馬神經元突起生長與凋亡并且可以調控小鼠海馬神經元“癇樣放電”。同時,TRPC4也參與到神經元興奮抑制性遞質釋放過程,過度激活可以擾亂皮質內“興奮/抑制”平衡。以上研究結果,強烈提示TRPC4可能是參與到癲癇發(fā)生發(fā)展的重要通道蛋白,其在MCD樣本中的表達模式及作用機制研究對于MCD相關癲癇的治療具有深遠意義。本研究中,我們以FCDⅡ型臨床樣本為研究對象,采用外顯子測序(Exome-seq)、轉錄組測序(RNA-seq)及生物信息學方法,對FCD Ⅱ型樣本的外顯子區(qū)突變及其下游轉錄信息進行全面系統(tǒng)的檢測與分析,得到準確可靠的遺傳學及功能學信息。同時,我們采用RT-PCR、Western Blot、免疫組織化學等技術手段,研究了 TRPC4及其上游分子PLCD1 (phospholipase C delta1)在MCD標本中的表達分布,分析了 TRPC4信號通路在MCD致癇灶中的潛在作用機制。主要結果如下:一、基于外顯子測序技術的FCDs基因突變分析1.本部分研究,我們采用外顯子測序及生物信息學手段,對FCD Ⅱ型及正常對照樣本外顯子區(qū)序列進行分析,我們發(fā)現(xiàn)眾多FCD Ⅱa特異性、FCD b特異性及FCD Ⅱ共同基因突變,包括GABA能抑制性通路、mTOR信號通路、細胞周期相關通路及TRP家族相關通路;2.對于FCD Ⅱ型樣本的單核苷酸變異進行分析,我們發(fā)現(xiàn)FCD Ⅱa中存在特異性神經細胞瘤斷裂點家族突變基因NBPF4、NBPF10、NBPF14及NBPF15突變,FCDⅡb中存在GABA能抑制性基因SLC6A11、SLC12A5突變,FCD Ⅱa與FCD Ⅱb共同突變包括mTOR通路中mTOR、PTEN基因和周期相關CDC27基因無義突變,以上突變涉及神經系統(tǒng)發(fā)育及癲癇發(fā)生的重要過程,可能是FCDⅡ型病理發(fā)生及癲癇發(fā)作的重要致病基因。3.對于FCD Ⅱ型樣本的拷貝數(shù)變異進行分析,我們發(fā)現(xiàn)FCDⅡa特異拷貝數(shù)變異富集到軸突導向過程,涉及基因包括EFNB2、EFNA1、PLXNA1及NTNG2。而FCDⅡb樣本中,拷貝數(shù)變異主要分布在mTOR信號通路與泛素化過程,包括TSC1、TSC2及CDC27基因拷貝數(shù)缺失。二者共同的拷貝數(shù)變異主要發(fā)生在TRP家族成員基因,包括TRPV1、TRPV4及TRPC4及FCD Ⅱ型中存在的基因拷貝數(shù)變異分布于細胞增殖、分化以及神經元電活動等生物學過程中,這些拷貝數(shù)變異可能會上調/下調相關基因的表達,從而參與到FCD Ⅱ型疾病的發(fā)生發(fā)展中。二、基于RNA-seq測序技術的FCDs基因轉錄譜分析1.本部分研究,我們選取FCD Ⅱa、FCD Ⅱb及正常腦組織為研究對象,運用轉錄組測序及生物信息學技術,系統(tǒng)研究了 FCD Ⅱ型標本的轉錄譜。我們發(fā)現(xiàn),測序研究得到的數(shù)據(jù)與既往研究一致性較好,并分析篩選得到FCD Ⅱa及Ⅱb共差異表達基因464個、FCD Ⅱa特異性差異基因536個和FCD Ⅱb特異性差異基因687個;2.通過對FCD Ⅱ型中464個共同差異表達基因,進行功能聚類分析,我們發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集到血管生成、陽離子運輸和P2嘌呤受體通路,涉及重要基因包括VEGFA、KCNJ10、CACNG4、TRPV1、TRPC4、P2X7R 及 P2Y12R。通過文獻回顧,我們分析得到以上基因可能參與到FCD Ⅱ型相關癲癇疾病發(fā)生發(fā)展過程,并可能成為難治性癲癇特異性治療的新靶點;3.通過對FCD Ⅱ亞型中特異性表達基因進行聚類分析,我們得到FCD Ⅱa相關差異表達基因主要聚類到離子通道相關通路,主要涉及SLC13A5、SLC1A6、GRIN3A、NMUR2及KCNK5基因;FCD Ⅱb特異性表達主要集中在細胞周期及中樞神經系統(tǒng)發(fā)育等通路,其中包括CDKN1C、CDKN2A及GDNF基因,這些基因的特異性表達為我們理解FCD Ⅱ亞型的特異性病理改變,提供了更多分子生物學證據(jù)及可靠的研究方向。三、TRPC4在MCD臨床標本中的表達與分布1.本部分研究,利用RT-PCR及Wesern Blot技術,我們發(fā)現(xiàn)正常腦組織內TRPC4 mRNA及蛋白均有表達,進一步免疫組織化學結果顯示,TRPC4蛋白主要分布在神經元、膠質細胞及血管內皮細胞中,并呈弱陽性表達;2.在MCD病灶組織中,TRPC4在FCDⅡa、FCD Ⅱb和TSC亞型的mRNA及蛋白表達水平均明顯高于正常腦組織(P 0.01)。進一步免疫組化及免疫熒光雙標研究發(fā)現(xiàn),TRPC4蛋白在DNs、BCs、GCs、星型膠質細胞及內皮細胞中呈強陽性表達,與對照組相比有顯著統(tǒng)計學差異(p0.01)。除此之外,TRPC4在MCD病灶中的vGlut1、GABA及GAD65+67陽性的中間神經元內均有分布。以上結果提示TRPC4在MCD致癇灶中可能起到重要作用;3.進一步研究表明,TRPC4上游互作分子PLCD1,在正常大腦皮層及MCD致癇灶內均有表達,且PLCD1在MCD各亞型中的表達與對照組相比具有顯著地統(tǒng)計學差異(p 0.01)。進一步免疫組化相關結果顯示,PLCD1高表達于MCD病灶中的異形細胞DNs、BCs和GCs中,這提示我們MCD病灶內可能是PLCD1調控TRPC4表達與功能作用,并參與到MCD致癇過程中。綜上所述,本研究結果表明:1.在FCD Ⅱ型患者病灶中,存在大量潛在致病基因突變,其中mTOR信號通路基因mTOR、PTEN、TSC及細胞周期相關基因CDC27突變可能參與到FCD Ⅱ型板層紊亂、異形細胞形成的病理改變過程中,GABA抑制性通路及TRP家族相關基因SLC6A11、SLC12A5及TPRC4突變則可能造成FCD Ⅱ型高癲癇易感性的病理特征;2.我們首次采用轉錄組測序手段,對FCD Ⅱ型疾病轉錄譜進行系統(tǒng)描繪,其中細胞周期、中樞神經系統(tǒng)發(fā)育通路相關基因CDKN1C及CDKN2A異常表達可能參與到FCD ⅡI特異性氣球樣細胞的病理形成過程,同時,離子通道相關基因SLC13A5、SLC1A6、KCNK5及TRPC4及的表達異�？赡茉斐蒄CD Ⅱ型腦區(qū)興奮抑制失衡,導致相關癲癇的發(fā)生發(fā)展;3.進一步研究發(fā)現(xiàn),TRPC4及其上游互作分子PLCD1在MCD臨床標本中表達水平顯著增加,并主要分布于異構神經元、血管內皮及反應性膠質細胞中。綜合以上結果,我們推斷:mTOR信號通路、細胞周期調控通路及離子通道對于FCD疾病的病理形成及癲癇發(fā)作起到極其重要的作用,同時,TRPC4在MCD癲癇發(fā)作過程中起到重要的致癇作用并作為MCD相關癲癇治療的新靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742.1

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本文編號：2407647