【摘要】：蛋白質(zhì)天冬酰胺連接的糖基化(N-糖基化)是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾途徑。在真核生物中,N-糖基化修飾起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),首先在磷酸多萜醇上合成寡糖鏈,然后由寡糖基轉(zhuǎn)移酶(Oligosaccharyltransferase,OST)將其轉(zhuǎn)移至多肽中的糖基化位點(diǎn)NXS/T(X指脯氨酸以外的其他氨基酸,N為天冬酰胺,S為絲氨酸,T為蘇氨酸)上,與天冬酰胺側(cè)鏈氨基上的氮原子共價(jià)連接。OST是由4到8個(gè)亞基組成的寡聚膜蛋白復(fù)合體,其中高度保守的STT3亞基具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性。低等真核生物,如酵母的OST復(fù)合體含有唯一的STT3亞基。高等真核生物,如動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)兩種OST復(fù)合體,按其轉(zhuǎn)移酶活性亞基的不同分為STT3A復(fù)合體和STT3B復(fù)合體。STT3A與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移通道相作用,在多肽延伸的同時(shí)將其糖基化,這與酵母中STT3功能相似。而靠近蛋白質(zhì)兩端或者含有半胱氨酸的糖基化位點(diǎn)容易被STT3A跳過(guò)。STT3B可以在STT3A跳過(guò)的糖基化位點(diǎn)處加上糖鏈,進(jìn)一步提高細(xì)胞糖基化效率。諸多研究表明,STT3B有其獨(dú)特的糖基化機(jī)制。STT3B功能相關(guān)的基因突變會(huì)導(dǎo)致諸多嚴(yán)重的基因疾病。我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)STT3B的功能和作用機(jī)制還缺乏全面的了解。為了構(gòu)建STT3B依賴(lài)型N-寡糖轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選細(xì)胞株,本研究通過(guò)定點(diǎn)突變?cè)趩误w增強(qiáng)綠色熒光蛋白(mEGFP)不同位置引入糖基化位點(diǎn)構(gòu)建可糖基化mEGFP(N-glycosylatable mEGFP,Ng-m EGFP)。并在其N(xiāo)端融合鈣網(wǎng)織蛋白的信號(hào)肽序列,同時(shí)在其C端加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列KDEL,從而將其定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在人胚腎293(HEK293)細(xì)胞STT3A或者STT3B敲除的細(xì)胞株中表達(dá)Ng-m EGFP,通過(guò)流式細(xì)胞儀分析和蛋白質(zhì)免疫印跡分析,篩選得到三個(gè)STT3B依賴(lài)型的糖基化突變體mEGFPQ185N,mEGFPK215T,mEGFPQ185N/N186C。這些突變體在STT3B敲除細(xì)胞株中無(wú)法被糖基化,且細(xì)胞熒光明顯弱于野生型和STT3A敲除細(xì)胞株。我們將熒光差異最明顯的mEGFPQ185N/N186C整合到HEK293細(xì)胞基因組上,篩選得到一株熒光對(duì)N-糖基化敏感的單細(xì)胞株。在該細(xì)胞株中敲除STT3B,基因敲除的混合細(xì)胞株出現(xiàn)兩個(gè)EGFP信號(hào)峰。結(jié)果表明該細(xì)胞株在STT3B依賴(lài)型N-寡糖轉(zhuǎn)移相關(guān)基因高通量篩選研究方面的應(yīng)用潛力。
[Abstract]:Protein asparagine-linked glycosylation (N-glycosylation) is an important post-translational protein modification pathway. In eukaryotes, N-glycosylation begins with the endoplasmic reticulum. First, oligosaccharide chains are synthesized on polyterpene phosphate alcohols, and then oligosaccharide chains are synthesized by oligosaccharide transferase (Oligosaccharyltransferase,). OST) was transferred to the glycosylation site NXS/T (X finger proline, N is asparagine, S is serine, T is threonine). OST is an oligomeric protein complex composed of 4 to 8 subunits, among which the highly conserved STT3 subunit has glycosyltransferase activity. The OST complex of lower eukaryotes, such as yeast, contains a unique STT3 subunit. Higher eukaryotes, such as animal cells, express two kinds of OST complexes, which are divided into STT3A complex and STT3B complex according to the different subunits of their transferase activity. STT3A acts with protein transfer channels and glycosylation of them while extending polypeptides. This is similar to the function of STT3 in yeast. The glycosylation sites near the two ends of the protein or containing cysteine are easily skipped by STT3A. STT3B can add sugar chains to the glycosylation sites skipped by STT3A and further improve the glycosylation efficiency of cells. Many studies have shown that STT3B has its unique glycosylation mechanism. Gene mutations associated with STT3B function can lead to many serious genetic diseases. We do not have a comprehensive understanding of the function and mechanism of intracellular STT3B. In order to construct a screening cell line of STT3B dependent N-oligosaccharide transfer related genes, a glycosylated mEGFP (N-glycosylatable mEGFP,) was constructed by introducing glycosylation sites into monomeric enhanced green fluorescent protein (mEGFP) by site-directed mutagenesis. Ng-m EGFP). The signal peptide sequence of calmodulin was fused at its N-terminal, and the endoplasmic reticulum retention signal sequence (KDEL,) was added to its C terminal to locate it to the endoplasmic reticulum (ER). Expression of Ng-m EGFP, in STT3A or STT3B knockout cell lines of human embryonic kidney 293 (HEK293) cells was screened by flow cytometry and Western blot analysis. Three STT3B dependent glycosylation mutants mEGFPQ185N,mEGFPK215T,mEGFPQ185N/N186C. were obtained. These mutants could not be glycosylated in STT3B knockout cell lines, and the fluorescence of these mutants was significantly weaker than that of wild type and STT3A knockout cell lines. We integrated mEGFPQ185N/N186C, which has the most obvious fluorescence difference, into the genome of HEK293 cells, and selected a single cell strain which was sensitive to N-glycosylation. There were two EGFP signal peaks in the mixed cell line with STT3B, gene knockout. The results showed that the cell line had potential in high-throughput screening of STT3B dependent N-oligosaccharide transfer related genes.
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2376611