【摘要】：【目的】西瓜細菌性果斑病由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起,是一種嚴重的世界性病害。細菌的鞭毛通常被認為是細菌的運動器官,在細菌的侵染過程中也起重要作用,已有報道表明這種作用可受鞭毛蛋白基因fliS的調(diào)控,目前西瓜細菌性果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS的功能及其調(diào)控機理尚不清楚,本研究旨在探討該基因在鞭毛形成和致病性等生物學特性中的作用。【方法】以果斑病菌野生型致病菌株1號基因組DNA為模板,設計一系列引物,PCR擴增敲除基因fliS的上下游片段,通過回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟構建敲除載體和互補載體,然后采用三親雜交法,根據(jù)同源重組的原理,構建fliS基因缺失突變菌株及其互補菌株,并對其鞭毛的形態(tài)特征、致病性、過敏反應、游動性、群體感應、菌膜、生長速率、菌落形態(tài)等生物學特性進行測定;進一步提取細菌總RNA,以谷氨酰胺合成酶基因glnA為參照來校正目標基因的表達量,采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法,比較野生菌株、敲除菌株和互補菌株部分鞭毛蛋白基因flh D、fliE、fliC、flgK、flgM、fliD和fliA的表達量差異�！窘Y果】通過抗性基因Gm的篩選和PCR驗證,成功構建了果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS缺失突變菌株1-fliS及其互補菌株1-fliShb,并對所得菌株的生物學特性和鞭毛進行觀察,結果表明,與野生菌株相比,鞭毛蛋白基因缺失突變菌株的游動性、菌膜形成能力減弱,互補后游動性、菌膜形成能力基本恢復;缺失突變菌株對甜瓜、西瓜幼苗以及西瓜果實的致病性降低,互補后對西瓜、甜瓜幼苗及西瓜果實的致病力完全恢復。電鏡測試顯示,突變菌株鞭毛變短,長度約為野生菌株的1/3—1/4,互補后鞭毛合成能力基本恢復,鞭毛長度約為野生菌的4/5;光學顯微鏡下,可觀察到在NA平板上的野生菌株菌落周圍有明顯的由細菌顫泳形成的特殊暈圈,而缺失突變菌株在NA平板上不能形成這種暈圈,互補后暈圈形成能力部分恢復;缺失突變菌株的生長速率比野生菌株慢,互補后生長速率沒有恢復;野生菌株、突變菌株和互補菌株在過敏性反應和群體感應方面無差異。qRT-PCR分析結果顯示,fliS基因缺失突變后,flh D表達量較野生菌株明顯降低,fliE、fliC和flgK表達量較野生菌株明顯升高,flgM和fliD表達量略微上升,fliA表達量基本不變;互補菌株中flhD、fliE和fliC表達量部分恢復,flgK、flgM和fliD表達量沒有恢復,與突變菌株相同�！窘Y論】鞭毛基因fliS對果斑病菌鞭毛絲的形成、游動性、菌膜形成能力、生長速率、菌落形態(tài)、致病性等均有調(diào)控作用。
[Abstract]:[objective] the bacterial fruit spot of watermelon is caused by Acidovorax citrulli,Ac, which is a serious worldwide disease. The flagella of bacteria is generally considered to be the motility organ of bacteria and plays an important role in bacterial infection. It has been reported that this action can be regulated by the flagellin gene fliS. At present, the function and regulation mechanism of flagellin gene fliS in bacterial fruit spot pathogen of watermelon are not clear. The purpose of this study was to investigate the role of the gene in the biological characteristics of flagella formation and pathogenicity. [methods] A series of primers were designed based on the genomic DNA of wild type pathogenic bacteria strain 1. The upstream and downstream fragments of knockout gene fliS were amplified by PCR. The knockout vector and complementary vector were constructed by recovery, enzyme digestion, ligation and transformation. The mutant strain of fliS gene deletion and its complementary strain were constructed, and the biological characteristics of flagella such as morphology, pathogenicity, hypersensitivity, swimming, colony induction, membrane, growth rate and colony morphology were determined. The total bacterial RNA, was further extracted to correct the expression of the target gene using glutamine synthase gene glnA as the reference, and real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) was used to compare the wild strains. Partial flagellin gene of knockout strain and complementary strain were differentially expressed between the two strains. [results] by screening the resistant gene Gm and verifying by PCR, the expression levels of fliD and fliA were different between the knockout strain and the complementary strain. The mutant strain 1-fliS with flagellin gene fliS deletion and its complementary strain 1-fliShbwere successfully constructed. The biological characteristics and flagella of the strain were observed. The flagellin gene deletion mutant strain had the ability of swimming, the ability of membrane formation was weakened, and the ability of membrane formation was basically recovered after complementation. The pathogenicity of the mutant to melon, watermelon seedling and watermelon fruit was decreased, and the pathogenicity of the mutant strain to watermelon, melon seedling and watermelon fruit was completely recovered after complementation. The results of electron microscopy showed that the flagella of the mutant strain became shorter and the length was about 1 / 3 / 1 / 4 of that of the wild strain, and the flagellum synthesis ability of the mutant was almost recovered after complementation, and the length of the flagella was about 4 / 5 of that of the wild strain. Under the optical microscope, it was observed that there was a special halo circle formed by bacterial fibrillation around the colony of wild strains on the NA plate, but the absent mutant strain could not form the halo circle on the NA plate, and the ability of halo formation was partly recovered after complementation. The growth rate of deletion mutant strain was slower than that of wild strain, but the growth rate did not recover after complementation. There was no difference in allergy and population induction between wild strain, mutant strain and complementary strain. QRT-PCR analysis showed that the expression of, flh D was significantly lower than that of wild strain after fliS gene deletion mutation, and fliE, was significantly lower than that of wild strain. The expression of fliC and flgK was significantly higher than that of wild strain, the expression of flgM and fliD was slightly increased, and the expression of fliA was almost unchanged. The expression of flhD,fliE and fliC was partially recovered in complementary strains, but the expression of flgK,flgM and fliD was not recovered, which was the same as that of mutant strains. [conclusion] flagellum gene fliS can induce flagellum formation, swimming, membrane formation and growth rate. Colony morphology, pathogenicity and so on all have the regulation function.
【作者單位】： 福建農(nóng)林大學植物保護學院;
【基金】：國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201003066-2) 福建省自然科學基金(2014J01084) 福建農(nóng)林大學發(fā)展基金(KF2015058);福建農(nóng)林大學科技創(chuàng)新專項基金(CXZX2016133)
【分類號】：S436.5

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

1 王鐵霖;楊玉文;關巍;趙廷昌;;西瓜嗜酸菌LuxR家族基因luxR_(4229)的功能研究[J];植物病理學報;2016年02期

2 劉麗云;郝帥;孫暉;;弗氏枸櫞酸桿菌CF74的FliS蛋白功能研究[J];中國人獸共患病學報;2015年06期

3 王文博;劉東;張艷菊;;黑龍江省西瓜細菌性果斑病發(fā)生初報[J];中國蔬菜;2013年02期

4 汪新;王衛(wèi);錢國良;王敏杰;胡白石;劉鳳權;;瓜類細菌性果斑病菌過敏性反應和致病性(hrp)基因簇部分基因的克隆及功能分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術學報;2011年01期

5 李明明;申初成;雷慶斌;周檢軍;簡建松;謝超;;細菌性果斑病菌源與接菌方法對西瓜致病力的影響[J];湖南農(nóng)業(yè)科學;2010年15期

6 劉鵬;趙廷昌;;哈密瓜細菌性果斑病菌群體感應系統(tǒng)的檢測[J];植物保護;2009年06期

7 薛莉;楊成德;陳秀蓉;賈迎春;雒東林;;甘肅省西瓜細菌性果斑病的診斷[J];植物保護;2009年02期

8 蔡學清;黃月英;楊建珍;陳軍;蔡國隆;胡方平;;福建省西瓜細菌性果斑病的病原鑒定[J];福建農(nóng)業(yè)大學學報;2005年04期

9 金巖,張俊杰,吳燕華,高潔;西瓜細菌性果斑病的發(fā)生與病原菌鑒定[J];吉林農(nóng)業(yè)大學學報;2004年03期

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1 李俊閣;甜瓜細菌性果斑病抗性鑒定及抗性相關生理研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學;2015年

2 陳嬌梅;西瓜嗜酸菌致病相關基因的篩選及功能分析[D];福建農(nóng)林大學;2015年

3 劉鵬;哈密瓜果斑病菌群體感應系統(tǒng)相關基因的克隆及其在檢測中的應用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2007年

【共引文獻】

相關期刊論文 前10條

1 楊丙燁;付丹;胡方平;蔡學清;;西瓜細菌性果斑病菌鞭毛基因fliS的功能分析[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2017年15期

2 毛云;蘇小龍;寧雪飛;李冠;;甜瓜果斑病致病基因生物信息學分析[J];北方園藝;2017年02期

3 謝慧婷;李戰(zhàn)彪;秦碧霞;楊世安;崔麗賢;鄧鐵軍;蔡健和;;廣西甜瓜細菌性果斑病病原鑒定及16S rDNA序列分析[J];南方農(nóng)業(yè)學報;2016年10期

4 胡金鳳;劉君;;黃瓜子葉細菌性果斑病菌侵染初期cDNA文庫的構建及質(zhì)量評價[J];新疆農(nóng)業(yè)科學;2016年09期

5 周迎輝;胡方平;蔡學清;;西瓜細菌性果斑病菌基因Aave-3192和Aave-2108的功能研究[J];熱帶作物學報;2016年07期

6 劉星;胡金鳳;王希東;劉君;;西瓜食酸菌CusB蛋白的生物信息學分析[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學;2016年05期

7 高玉紅;閆生輝;鄧黎黎;;西瓜種子帶菌對幼苗細菌性果斑病發(fā)生和侵染途徑的影響[J];北方園藝;2016年05期

8 李賓;李愛寧;魏強;王海明;賀偉;;歐美楊細菌性潰瘍病菌hrcJ基因的功能分析[J];林業(yè)科學;2015年12期

9 陳亮;張力群;劉君麗;孫寶祥;;離體試驗與活體檢測相結合的殺細菌劑篩選[J];農(nóng)藥;2015年12期

10 王雪;王秀華;劉曉暢;解林昊;楊麗娜;高潔;;三十七種生物農(nóng)藥對西瓜細菌性果斑病菌的室內(nèi)抑菌效果測定[J];北方園藝;2015年19期

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1 周迎輝;西瓜噬酸菌基因Aave-3192、Aave-2108和Aave-4679、Aave-2716的功能研究[D];福建農(nóng)林大學;2016年

2 張夢洋;外源水楊酸對黃瓜抗細菌性果斑病誘導效果及其生理機制研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 陳好娟;Pichia anomala 0732-1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及其抑菌成分的研究[D];石河子大學;2014年

4 汪超;西瓜嗜酸菌鞭毛突變體的篩選及功能研究[D];福建農(nóng)林大學;2014年

5 王鐵霖;瓜類果斑病菌群體感應系統(tǒng)luxR/luxI功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2012年

6 嚴婉榮;瓜類細菌性果斑病菌hrcN基因的克隆及功能分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2012年

【二級參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 趙文祥;韓陽春;崔一平;趙梅勤;李玉蓉;鄒麗芳;陳功友;;Ⅲ型分泌裝置蛋白HrcJ決定條斑病菌在植物上的過敏反應和致病性的研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2010年01期

2 呂小云;周檢軍;龍艷梅;徐恩林;;不同瓜類作物對西瓜細菌性果斑病的抗病性試驗[J];湖南農(nóng)業(yè)科學;2009年11期

3 趙廷昌;趙洪海;王懷松;;山東省西瓜、甜瓜發(fā)生瓜類細菌性果斑病[J];植物保護;2009年05期

4 姜佳;鄒華松;李玉蓉;陳功友;;水稻條斑病菌hrcC、hpa3和hrpE基因表達不依賴hrpG和hrpX基因調(diào)控[J];微生物學報;2009年08期

5 高原;馬延;毛峗峗;李玉霞;凌焱;張京生;周圍;梁龍;;新預測的Ⅲ型分泌系統(tǒng)毒力蛋白Z3672的基因克隆、表達及純化[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2009年03期

6 粟寒;吳翠萍;李彬;黃艷霞;高淵;;免疫檢測試紙條法檢測西瓜子中的瓜類果斑病菌[J];植物檢疫;2009年01期

7 楊小麗;馬俊義;胡白石;陳濤;李曉霞;;不同哈密瓜品種苗期對細菌性果斑病的抗病性鑒定[J];新疆農(nóng)業(yè)科學;2008年03期

8 王喜慶;;黑龍江省西瓜甜瓜生產(chǎn)現(xiàn)狀、存在的問題和對策[J];中國瓜菜;2008年02期

9 回文廣;趙廷昌;Schaad N W;孫福在;王建榮;;哈密瓜細菌性果斑病菌快速檢測方法的建立[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2007年11期

10 李威;任毓忠;丁建軍;侯鵬;謝方生;;新疆瓜類細菌性果斑病品種抗病性鑒定[J];北方園藝;2007年03期

相關碩士學位論文 前10條

1 張美鑫;我國梨腐爛病菌致病力分化分析及不同梨種質(zhì)資源的抗病性鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2014年

2 賈宋楠;粘籽西瓜與籽用西瓜種質(zhì)遺傳性狀及抗病性評價[D];新疆農(nóng)業(yè)大學;2013年

3 張靜;西甜瓜細菌性果斑病種子藥劑處理技術研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2012年

4 嚴婉榮;瓜類細菌性果斑病菌hrcN基因的克隆及功能分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2012年

5 趙玉強;瓜類細菌性果斑病菌致病相關基因篩選及l(fā)uxR基因功能分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2010年

6 胥婧;哈密瓜細菌性果斑病菌的分子檢測及群體遺傳分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2007年

7 王笑;我國西瓜果斑病的發(fā)生概況及種子帶菌檢測的研究[D];浙江大學;2007年

8 彭軍;哈密瓜細菌性果斑病菌致病力分化的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2007年

9 鄭喜清;哈密瓜品種對細菌性果斑病抗性指標的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2007年

10 翟艷霞;哈密瓜品種對細菌性果斑病菌的抗性鑒定及抗性機制的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2006年

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本文編號：2375136