【摘要】：動(dòng)物模型在疾病致病機(jī)制、疫苗和藥物的研發(fā)評(píng)價(jià)等臨床前試驗(yàn)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)揮了重要作用。但現(xiàn)有動(dòng)物模型仍存在一定的局限性,如小鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物,在遺傳背景、生理及免疫狀態(tài)上均與人類存在著差異,尤其是MHC限制性的差別,無(wú)法消除種屬特異性的影響,難以準(zhǔn)確反應(yīng)人類免疫特征,導(dǎo)致許多臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與人體臨床反應(yīng)迥異。此外,免疫缺陷小鼠NOD/SCID小鼠等盡管在移植和腫瘤免疫等研究中得到應(yīng)用,但由于小鼠H-2與人HLA限制性的差異,仍存在著免疫排斥及移植效率低等問(wèn)題。因此,如何培育出人源化程度更高、能夠更加有效模擬人類免疫反應(yīng)的動(dòng)物模型是目前人源化動(dòng)物模型研究亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題之一。MHC是廣泛存在于人類和哺乳動(dòng)物中多態(tài)性最為豐富的基因之一,參與T細(xì)胞在胸腺中的選擇,發(fā)揮限制性作用調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等。小鼠和人類的MHC在結(jié)構(gòu)和功能上雖十分相似,但其MHC免疫限制性功能卻完全不同。人MHC優(yōu)勢(shì)基因型分布存在種族差異,中國(guó)人群與歐美、中東及其他地區(qū)MHC優(yōu)勢(shì)基因型有顯著差異。中國(guó)人群HLA-I類優(yōu)勢(shì)亞型以HLA-A2、A11和A24為主,而歐美人群則主要是A2、A1和A3等;中國(guó)人群HLA-II類分子優(yōu)勢(shì)亞型主要是DR09、DR15和DR01等,而歐美及中東人群則以DR01、DR03和DR04為主。人MHC轉(zhuǎn)基因小鼠模型是通過(guò)將HLA轉(zhuǎn)入小鼠基因組中,同時(shí)敲除小鼠H-2的重要組分,從而排除H-2對(duì)外源HLA的競(jìng)爭(zhēng)性抑制,能夠更加準(zhǔn)確、有效的反應(yīng)HLA作用特征。本課題旨在構(gòu)建能夠體現(xiàn)中國(guó)人群優(yōu)勢(shì)MHC基因型的HLA-A11/DR1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行疫苗的評(píng)價(jià)和新發(fā)病原表位鑒定等實(shí)驗(yàn)研究;構(gòu)建和培育人MHC免疫缺陷小鼠模型HUMAMICE(HLA-A2+/+/DR1+/+/H-2-β2m-/-/IAβ-/-/Rag2-/-/IL-2rγ-/-/Perf-/-),建立人源細(xì)胞移植免疫重建小鼠模型,為病原感染模型研究、腫瘤和移植免疫機(jī)制研究及疫苗、藥物評(píng)價(jià)等提供技術(shù)支撐。1.人MHC(HLA-A11/DR1)雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立及其應(yīng)用基礎(chǔ)研究1.1 HLA-A11/DR1小鼠模型建立及免疫功能分析:構(gòu)建包含HLA-A11啟動(dòng)子、輕鏈β2m,重鏈α1和α2、H-2-Db的α3和跨膜區(qū)的HLA-A11嵌合轉(zhuǎn)基因載體,通過(guò)顯微注射導(dǎo)入小鼠受精卵中,胚胎移植后獲得HLA-A11轉(zhuǎn)基因首建鼠;選擇A11表達(dá)量最高的轉(zhuǎn)基因首建鼠與HLA-A2/DR1小鼠進(jìn)行雜交,構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的HLA-A11+/+/DR1+/+H-2-β2m-/-/IAβ-/-小鼠;鑒定到HLA在小鼠基因組中的整合及H-2的敲除;檢測(cè)到HLA在A11/DR1小鼠脾細(xì)胞表面的表達(dá)顯著強(qiáng)于C57BL/6及全陰小鼠;HLA-A11/DR1小鼠體內(nèi)檢測(cè)到相對(duì)正常數(shù)量的CD8+和CD4+T細(xì)胞,說(shuō)明HLA能夠滿足淋巴細(xì)胞在胸腺中完成選擇,發(fā)育為成熟的t淋巴細(xì)胞;利用已知hla-a11表位hiv-pol177-188和hiv-gp16032-45能特異性刺激a11/dr1小鼠產(chǎn)生hla-a11限制性ctl反應(yīng),證明a11/dr1小鼠具有hla-a11限制性免疫反應(yīng)功能。1.2hla-a11/dr1小鼠模型在疫苗研發(fā)及評(píng)價(jià)中的應(yīng)用(1)hla-a11/dr1小鼠模型在疫苗免疫評(píng)價(jià)中的應(yīng)用:將商業(yè)化疫苗啤酒酵母基因工程乙肝疫苗和新型疫苗hiv-mep1作為模式抗原,免疫后小鼠血清中特異性igg抗體均顯著上升;elispot檢測(cè)表明以hiv-mep1和hiv-1多肽刺激,均產(chǎn)生了高水平的特異性細(xì)胞免疫;在hbsag疫苗的刺激下,a11/dr1小鼠產(chǎn)生的ifn-γ是c57bl/6小鼠的3-4倍。證明hla-a11/dr1小鼠在特異性抗原的刺激下產(chǎn)生了良好的體液和細(xì)胞免疫,能應(yīng)用于疫苗的免疫評(píng)價(jià)中,尤其適用于細(xì)胞免疫反應(yīng)的評(píng)價(jià)。(2)以hla-a11/dr1小鼠模型為基礎(chǔ)的hla-a11限制性ctl表位篩選鑒定:通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)綜合預(yù)測(cè)和分析了24個(gè)ebovgp蛋白和mers-covs蛋白與hla-a11結(jié)合力較強(qiáng)的候選表位。利用hla-a11/dr1小鼠驗(yàn)證和鑒定得到2個(gè)ebov-gp(ebov-gp76-84和ebov-gp423-431)和4個(gè)mers-cov-s(mers-s152-160、mers-s720-728、mers-s889-897和mers-s1092-1100)的hla-a11限制性表位肽。實(shí)驗(yàn)表明該轉(zhuǎn)基因小鼠模型可有效進(jìn)行病原表位篩選和鑒定。2.人mhc免疫缺陷小鼠(humamice)的建立及人源細(xì)胞移植小鼠模型研究2.1humamice的建立及免疫缺陷功能分析(1)humamice的制備及鑒定:將hla-a2/dr1小鼠(hla-a2+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-)與rag2-/-小鼠、il-2rγ-/-小鼠和perf-/-小鼠進(jìn)行雜交繁殖,獲得人mhc免疫缺陷小鼠humamice(hla-a2+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-/rag2-/-/il-2rγ-/-/perf-/-)。鑒定了hla的整合,h-2-β2m、iaβ、rag2、il-2rγ和perf的敲除及穩(wěn)定遺傳,檢測(cè)到a2特異性表達(dá);humamice體內(nèi)未檢測(cè)到cd3+cd4+、cd3+cd8+和cd19+cd20+細(xì)胞,表明在rag2、il-2rγ和perf缺陷的共同作用下,humamicet、b及nk細(xì)胞缺失。(2)humamice的免疫缺陷功能分析:取humamice和a2/dr1小鼠的免疫器官進(jìn)行he染色,發(fā)現(xiàn)humamice的脾臟萎縮、胸腺發(fā)育不全,脾小體和胸腺小葉結(jié)構(gòu)不完整甚至缺失,a2/dr1小鼠則具有結(jié)構(gòu)正常的胸腺和脾臟。將ramos皮下接種以上兩種小鼠,30天后,humamice均產(chǎn)生腫瘤,而a2/dr1小鼠則未發(fā)生腫瘤。向已發(fā)生腫瘤的humamice過(guò)繼回輸a2/dr1小鼠(接種ramos后未發(fā)生腫瘤)的脾細(xì)胞、cd8+t及其他免疫細(xì)胞,均能在一定程度上使humamice的腫瘤變小。結(jié)果表明humamice的免疫器官發(fā)育不成熟、免疫功能缺陷,移植腫瘤細(xì)胞后能夠成瘤,能夠支持腫瘤模型的建立。2.2humamice人源細(xì)胞移植和免疫重建特征分析(1)人源細(xì)胞(hpbmc)移植humamice及其免疫反應(yīng)功能分析:篩選獲得hla-a2+/dr1+pbmc樣本;在小鼠全身輻射處理后的24h內(nèi)進(jìn)行人源細(xì)胞移植,10天后用hbsag疫苗免疫小鼠。在humamice進(jìn)行hla匹配的hpbmc移植的60天內(nèi),實(shí)驗(yàn)組的體重較對(duì)照組并未顯著下降,說(shuō)明在humamice進(jìn)行人源pbmc移植后并未發(fā)生gvhd反應(yīng)。hbsag疫苗免疫h(yuǎn)umamice后,血清中hbsag特異性igg人源抗體在加強(qiáng)免疫后顯著上升,igm人源抗體則在二免時(shí)達(dá)到頂峰。(2)humamice人源細(xì)胞移植后的免疫重建效率的分析:在人源細(xì)胞移植后的第五、八周,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)humamice脾細(xì)胞中hcd45+t細(xì)胞占11.6%和9.70%,其中hcd45+hcd19+占45.2%和49.4%,hcd45+hcd3+占17.1%和16.1%,hcd3+hcd8+占hcd45+hcd3+的29.0%和30.0%、hcd3+hcd4+占hcd45+hcd3+的60.9%和59.0%。結(jié)果表明,humamice在進(jìn)行hla-a2+/dr1+pbmc移植后,脾臟中發(fā)現(xiàn)人源細(xì)胞,其免疫系統(tǒng)獲得重建。3.研究結(jié)論(1)本研究成功建立和培育了具有中國(guó)人群hla優(yōu)勢(shì)基因型的hla-a11/dr1(hla-a11+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-)雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型,該轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有人mhc免疫限制性特征及正常的免疫應(yīng)答功能,疫苗評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)表明該模型可以有效地應(yīng)用于疫苗免疫評(píng)價(jià)研究中。利用該小鼠模型開展了重要病毒新型表位的預(yù)測(cè)、篩選和鑒定,獲得兩個(gè)位于ebovgp蛋白和四個(gè)mers-covs蛋白中的hla-a11限制性ctl表位。上述研究表明該人mhc雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型能夠有效應(yīng)用于針對(duì)中國(guó)人群的重要病原體hla限制性ctl和th表位的篩選和鑒定等研究中。本研究建立的人mhc雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型為免疫限制性機(jī)制研究、疫苗的研發(fā)和評(píng)價(jià)等提供了一種新的技術(shù)手段。(2)本研究成功建立和培育了人mhc免疫缺陷小鼠模型humamice(hla-a2+/+/dr1+/+/h-2-β2m-/-/iaβ-/-/rag2-/-/il-2rγ-/-/perf-/-)。該小鼠模型不僅具有人mhci類及ii類分子限制性特征(即hla-a2和hla-dr1限制性),而且其t、b及nk細(xì)胞缺失,脾臟和胸腺發(fā)育不完全;在進(jìn)行人源細(xì)胞(hla-a2+/dr1+pbmc)移植的三個(gè)月內(nèi)humamice未發(fā)生gvhd反應(yīng),移植后小鼠脾細(xì)胞中檢測(cè)出人源cd45+細(xì)胞(hcd3+cd8+、hcd3+cd4+)。移植后humamice小鼠免疫h(yuǎn)bsag疫苗后,能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性igm和igg人源抗體,表明該人mhc免疫缺陷小鼠模型的免疫系統(tǒng)獲得了人源化重建。人mhc免疫缺陷小鼠模型(humamice)為病原感染動(dòng)物模型的建立、人源抗體制備和藥物評(píng)價(jià)等研究提供了一種新型免疫實(shí)驗(yàn)研究模型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R-332

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本文編號(hào)：2367327