【摘要】：克隆家蠅內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因并建立原核表達(dá)體系,檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物的活性,了解家蠅內(nèi)源性BG酶特點(diǎn),為進(jìn)一步解釋家蠅極強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)能力和發(fā)現(xiàn)新的種群控制措施提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。以草地貪夜蛾等結(jié)構(gòu)信息相對(duì)完整且研究較為透徹的6種代表性昆蟲的BG酶基因序列為參照對(duì)象,利用同源克隆結(jié)合RACE-PCR的方法,從家蠅cDNA中克隆得到BG酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分別采用原核表達(dá)載體pET-28a(+)構(gòu)建原核表達(dá)體系并在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)BG酶基因的融合蛋白。采用七葉苷平板顯色法和DNS法檢測(cè)表達(dá)體系融合蛋白的酶活性,并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行初步的分析。家蠅體內(nèi)克隆得到了長(zhǎng)度為1933 bp的家蠅BG酶基因全長(zhǎng)cDNA序列,推導(dǎo)其為562個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白多肽。重組原核質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,在65 kDa附近均出現(xiàn)特異性蛋白條帶,證實(shí)重組質(zhì)粒成功表達(dá)。重組表達(dá)的家蠅BG酶兼具內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和BG的酶活性。家蠅BG酶是一種新的多功能纖維素酶,是昆蟲纖維素酶研究的重要補(bǔ)充。
[Abstract]:The endogenous 尾 -glucosidase (beta-glucosidase,BG) gene was cloned and the prokaryotic expression system was established. It provides molecular biological basis for explaining the strong adaptability of housefly to environment and discovering new population control measures. The BG gene sequences of six representative insects were compared by using homologous cloning combined with RACE-PCR. The full-length cDNA sequence of BG enzyme gene was cloned from housefly cDNA and analyzed by bioinformatics. The prokaryotic expression system was constructed using prokaryotic expression vector pET-28a () and the fusion protein of BG enzyme gene was induced and expressed in Escherichia coli E.coli BL21 (DE3). The enzyme activity of fusion protein in the expression system was detected by the method of aescin plate coloration and DNS, and the properties of the fusion protein were preliminarily analyzed. The full-length cDNA sequence of housefly BG gene with length of 1933 bp was cloned in vivo, and the protein polypeptide composed of 562-amino acid residues was deduced. After induced expression of recombinant prokaryotic plasmids, specific protein bands were found near 65 kDa, which confirmed that the recombinant plasmids were successfully expressed. The recombinant housefly BG enzyme had the enzyme activities of endoglucanase, exoglucanase and BG. Housefly BG enzyme is a new multifunctional cellulase and an important supplement to insect cellulase research.
【作者單位】： 貴州醫(yī)科大學(xué)臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué)教研室;貴州醫(yī)科大學(xué)人體寄生蟲學(xué)教研室;
【基金】：貴州省教育廳培育項(xiàng)目[(2009)0137] 國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2011BAC06B12) 國(guó)家自然科學(xué)基金(30960343) 國(guó)家教育部博士點(diǎn)專項(xiàng)基金[(2008)220]
【分類號(hào)】：Q963

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本文編號(hào)：2365006