【摘要】：抗菌肽是在甲殼動物先天性免疫中發(fā)揮重要作用的幾類小分子肽的總稱,其中crustin是很重要的一類抗菌肽。本研究中,我們旨在研究日本對蝦(Marsupenaeus Japonicus)在感染白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)或溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)時,類甲殼肽(crustin-like)基因所發(fā)揮的免疫功能。通過cDNA末端快速擴增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE),從日本對蝦體內(nèi)克隆到一條全長為660 bp的cDNA序列,軟件推測分析顯示該基因的開放閱讀框大小為507bp,編碼一個含有168個氨基酸殘基的蛋白,基因3′末端含有一條Poly(A)尾巴,5′和3′的非編碼區(qū)分別為72 bp和81 bp,推測出蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為16.22 kDa,pI為8.37。氨基酸序列比對和進化樹分析顯示crustin-like基因主要存在于甲殼動物中的對蝦及少部分螃蟹中,其中在日本對蝦發(fā)現(xiàn)的crutstin-like與凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)親緣關(guān)系較近。通過實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測基因表達的組織特異性發(fā)現(xiàn)crustin-like在鰓內(nèi)表達量最高,在血淋巴、肝胰腺、肌肉和消化腺內(nèi)表達量較低。通過double-strand RNA(dsRNA)干擾技術(shù),體外構(gòu)建dsRNA表達載體,將純化后的dsRNA注射到對蝦體內(nèi),成功地抑制了crustin-like基因的表達。對已知重要的免疫相關(guān)基因的檢測結(jié)果顯示,在crustin-like被沉默后,對蝦先天性免疫系統(tǒng)中多個免疫相關(guān)基因的表達受到影響,其中Immune deficiency homolog(IMD)、Rab7、L-lectin、mitogen-activated protein kinase(MAPK)、p53、prophenoloxidase(proPO)和Rho基因的表達顯著下調(diào),而nitric oxide synthase(NOS)、myosin及Tumor necrosis factor-α(TNF-α)基因的表達顯著上調(diào)。對蝦免疫活性試驗顯示,在抑制crustin-like基因的表達后,對蝦血細胞總數(shù)顯著減少,酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著減低。以上結(jié)果說明crustin-like對細胞吞噬作用、凋亡和部分免疫通路有顯著的影響。進一步研究發(fā)現(xiàn),在感染溶藻弧菌后,crustin-like基因的表達顯著上調(diào)。統(tǒng)計死亡率發(fā)現(xiàn),沉默crustin-like基因的表達后,對蝦感染弧菌后累計死亡率顯著增加。結(jié)果說明對蝦crustin-like有明顯的抗弧菌的作用。血細胞吞噬試驗結(jié)果顯示,對蝦crustin-like基因被沉默后,對蝦血細胞對溶藻弧菌的吞噬率顯著升高,血淋巴細胞凋亡率顯著升高,結(jié)果說明溶藻弧菌在感染對蝦時可能會利用crustin-like來逃避對蝦血細胞對弧菌的吞噬作用,這一現(xiàn)象還有待進一步的研究。在感染W(wǎng)SSV后12-72 h,crustin-like基因的表達顯著升高。WSSV拷貝數(shù)檢測和Kaplan Meier生存分析結(jié)果顯示crustin-like基因被沉默后,WSSV拷貝數(shù)顯著降低,對蝦存活率顯著升高。抑制crustin-like基因的表達后,對蝦血細胞對WSSV的吞噬率顯著降低,對蝦血細胞的凋亡顯著升高。以上結(jié)果說明對蝦crustin-like可以抑制細胞凋亡,而WSSV有可能利用crustin-like抑制細胞凋亡的功能來促進病毒粒子在對蝦體內(nèi)的復(fù)制。本文首次揭示了類甲殼肽在對蝦病毒感染中有著重要作用,為研究對蝦的先天性免疫和WSSV感染宿主的機制提供了重要的理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S945.49

【參考文獻】

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本文編號：2362563