【摘要】：研制出肉質(zhì)優(yōu)良并且高產(chǎn)量的家畜一貫是我們畜牧生產(chǎn)所尋求的目標(biāo)。傳統(tǒng)的雜交育種存在諸多問題,例如周期長(zhǎng),效率低,易變異等。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可在短期內(nèi)培育出優(yōu)質(zhì)的家畜,應(yīng)用市場(chǎng)十分廣泛。高效肌肉特異性啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)外源基因在骨骼肌細(xì)胞中的高效表達(dá),對(duì)于提高轉(zhuǎn)基因家畜肉的生產(chǎn)具有重要意義。結(jié)蛋白是肌組織中重要的細(xì)胞骨架蛋白,是中間纖維主要成分之一,其在肌肉形態(tài)的形成與維持、肌細(xì)胞的分化凋控、細(xì)胞之間的信息傳遞等諸多方面發(fā)揮著重要作用。結(jié)蛋白基因啟動(dòng)子可以指導(dǎo)外源基因的特異性表達(dá),但是作為畜牧生產(chǎn)所需的啟動(dòng)子,其轉(zhuǎn)錄活性不夠,因此利用分子克隆技術(shù)對(duì)結(jié)蛋白基因啟動(dòng)子片段進(jìn)行改造,我們希望獲得一個(gè)具有較高啟動(dòng)活性和肌肉組織特異性的啟動(dòng)子。本實(shí)驗(yàn)以desmin300啟動(dòng)子為研究對(duì)象,通過PCR擴(kuò)增desmin300中含有多個(gè)正調(diào)控元件的序列,將其連入desmin300上游,構(gòu)建含有多個(gè)正調(diào)控元件的序列的重組啟動(dòng)子;將含有α-actin基因啟動(dòng)子以及Myo G基因啟動(dòng)子的部分調(diào)控元件的序列,連到desmin300啟動(dòng)子當(dāng)中,構(gòu)建含有兩拷貝調(diào)控元件的重組啟動(dòng)子;將多拷貝調(diào)控元件與desmin300進(jìn)行串聯(lián),構(gòu)建含有多拷貝調(diào)控元件的重組啟動(dòng)子;構(gòu)建真核表達(dá)載體;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞,檢測(cè)改造后的牛desmin基因啟動(dòng)子的活性和肌肉特異性。具體研究結(jié)果如下:1.利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)牛結(jié)蛋白基因啟動(dòng)子300 bp調(diào)控區(qū)有3個(gè)CTCF、1個(gè)CPBP、1個(gè)Myo D、2個(gè)EGRF、1個(gè)AP2、1個(gè)Pax3、1個(gè)TFIIB、1個(gè)Sp1等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控結(jié)合位點(diǎn)。2.應(yīng)用PCR定點(diǎn)突變的方法,定點(diǎn)突變牛desmin300啟動(dòng)子片段中的CTCF元件,并構(gòu)建p GL3-desmin300-CTCF質(zhì)粒,通過熒光素酶報(bào)告檢測(cè)啟動(dòng)子活性發(fā)現(xiàn),突變CTCF元件后,在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的突變啟動(dòng)子p GL3-desmin300-CTCF的活性低于野生型單啟動(dòng)子p GL3-desmin300,證明CTCF轉(zhuǎn)錄元件為牛desmin啟動(dòng)子的正調(diào)控元件。3.我們將野生型啟動(dòng)子p GL3-desmin300以及定點(diǎn)突變后的啟動(dòng)子p GL3-desmin300-CTCF,分別和含有CTCF的外源基因p My-CTCF-GFP共轉(zhuǎn)染。結(jié)果表明,突變啟動(dòng)子的活性和其與外源基因共轉(zhuǎn)染后的活性相近,而野生型啟動(dòng)子和外源基因共轉(zhuǎn)染后的活性要明顯高于野生型啟動(dòng)子的活性,這證明CTCF元件在結(jié)蛋白啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控位點(diǎn)相結(jié)合并對(duì)轉(zhuǎn)錄有著正調(diào)控作用。4.將含有α-actin基因啟動(dòng)子以及Myo G基因啟動(dòng)子的部分調(diào)控元件的序列,連到牛desmin啟動(dòng)子當(dāng)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒p GL3-MD-αD(1)-desmin300和p GL3-αD(2)-αD(1)-desmin300。結(jié)果表明,p GL3-MD-αD(1)-desmin300和p GL3-αD(2)-αD(1)-desmin300的啟動(dòng)子活性分別是野生型啟動(dòng)子p GL3-desmin300的2.56和2.88倍,說明改造后的啟動(dòng)子片段具有較高的啟動(dòng)活性且具有肌肉特異性。5.我們進(jìn)一步的又將PCR擴(kuò)增的含有多個(gè)正調(diào)控元件的DOUBLE序列連入含有兩拷貝調(diào)控元件的重組啟動(dòng)子中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),改造后的重組啟動(dòng)子活性會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)并且仍然具有肌肉特性,重組啟動(dòng)子pGL3-MD-αD(1)-desmin300-DOUBLE3,p GL3-αD(2)-αD(1)-desmin300-DOUBLE3,p GL3-MD-αD(1)-desmin300-DOUBLE2,p GL3-αD(2)-αD(1)-desmin300-DOUBLE2的活性分別是野生型啟動(dòng)子p GL3-desmin300的3.49倍,3.68倍,4.1倍和4.39倍。本研究為轉(zhuǎn)基因家畜肉質(zhì)性狀改良的研究提供更加適合的高效肌肉特異性啟動(dòng)子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2358745