發(fā)布時間：2018-11-23 19:54

【摘要】：背景：在中國,每年有約700萬腦血病患者,近70%為腦梗死。EPCs既具有干細胞特性,也具有ECs特性,在缺血性疾病中,參與血管生成。EPCs通過參與血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重建和生長因子或細胞因子的旁分泌,刺激局部ECs遷移、生長和功能實現(xiàn),增強腦缺血后神經(jīng)修復(fù)。VEGF在缺血組織中,不僅促進血管新生血管生成,還趨化循環(huán)內(nèi)皮前體細胞歸巢到缺血性病灶,并且原位分化血管發(fā)生。在MCAO大鼠模型中,EPCs通過趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子1(SDF-1)以及其受體C-X-C趨化因子受體4型(CXCR4)組成的生物軸,參與神經(jīng)血管新生。組織氧含量降低,HIF-1α上調(diào)表達,提供細胞保護和生血管作用。目的：VEGF基因修飾的EPCs治療腦缺血模型大鼠,探索EPCs和VEGF參與腦缺血的血管新生的效果和機制。方法：通過RT-PCR方法從雄性Wistar大鼠血液的單個核細胞中獲取VEGF164,構(gòu)建pLVX-VEGF164-IRES-ZsGreenl,進行酶切、測序鑒定,及mRNA和蛋白水平上的功能鑒定。采用梯度分離法從雄性Wistar大鼠的骨髓中分離并體外培養(yǎng)EPCs；觀察EPCs細胞形態(tài)學(xué)和免疫熒光染色標記CD133、CD34和PKDR。將攜帶VEGF的慢病毒載體感染EPCs,獲得VEGF基因修飾的EPCs (EPCs-VEGF)。立體定位移植PBS、EPCs和EPCs-VEGF到MCAO模型大鼠的側(cè)腦室。通過mNSS、體重指數(shù)等神經(jīng)功能評估,免疫組織化學(xué)染,免疫熒光雙染,Tunel染色和Vestern blotting方法分析,比較第1,3,7,14天PBS治療組和EPCs治療組的病理變化和治療效果,并探討和分析MCAO模型建立第7天時,PBS、EPCs和EPCs-VEGF治療組中HIF-1α, VEGF, MMP-9, CD34, SDF-1和CXCR4的蛋白表達情況結(jié)果：(1)構(gòu)建了pLVX-VEGF164-IRES-ZsGreenl,在293T細胞中成功包裝了攜帶VEGF164的慢病毒載體,并在mRNA和蛋白水平穩(wěn)定表達。(2)采用梯度離心,體外培養(yǎng)EPCs,免疫熒光標記CD133, CD34和KDR陽性表達鑒定EPCs。(3)攜帶VEGF164的慢病毒載體感染EPCs,感染后的EPCs (EPCs-VEGF)綠色熒光表達量70%以上,Western blotting結(jié)果EPCs-VEGF的VEGF蛋白表達上調(diào),與EPCs具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(4)PBS和EPCs立體定位注射到MCAO大鼠的側(cè)腦室,兩組大鼠在第7天mNSS、體重比有顯著差異(P0.01)。免疫組織化學(xué)和Western blotting結(jié)果顯示VEGF在第7天表達量達到高峰,CD34逐漸升高,半暗帶區(qū)的細胞凋亡隨時間延長而改善,而HIF-la在缺血早期高表達,兩組間在第3,7,14天存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(5)PBS、EPCs和EPCs-VEGF立體定位注射到MCAO大鼠的側(cè)腦室,第7天的mNSS,體重比,各組間有顯著差異(P0.05)。免疫組織化學(xué)和Western blotting結(jié)果顯示VEGF, HIF-1α, CD34, SDF-1和CXCR-4在EPCs-VEGF治療組表達量最最高,MMP-9在PBS組表達量最大,存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論：(1)構(gòu)建了pLVX-VEGF164-IRES-ZsGreen1質(zhì)粒,并成功包裝成攜帶VEGF的慢病毒載體,慢病毒在RNA和蛋白水平有效表達VEGF。(2)獲得骨髓來源的EPCs,并對EPCs進行了鑒定,獲得了符合實驗要求細胞。(3)成功構(gòu)建了過表達VEGF164基因的EPCs,通過MCAO模型鼠的治療,驗證了EPCs和VEGF通過HIF-VEGF和SDF-1/CXCR4信號途徑,參與大鼠腦梗死的血管新生過程,改善了神經(jīng)功能,縮小梗死灶體積,促進功能恢復(fù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3

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本文編號：2352539