【摘要】：目的制備地高辛標(biāo)記基因探針,利用分子雜交試驗(yàn)同時(shí)檢測手足口病患者糞便標(biāo)本中的腸道病毒(Pan-enterovirus,PE)、腸道病毒71型(Enterovirs 71EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxsachie virus,CoxA16)。方法根據(jù)GenBank已發(fā)表的基因序列,分別在PE、EV71、CoxA16保守區(qū)設(shè)計(jì)3對特異性寡核苷酸引物,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。從PE、EV71、CoxA16陽性標(biāo)本中分離病毒,提取RNA,以RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為基因探針的目的基因,采用隨機(jī)引物法進(jìn)行Digxigenin-11-dUTP標(biāo)記,采用分子雜交試驗(yàn)檢測3種基因探針的靈敏性和特異性。結(jié)果 RTPCR分別擴(kuò)增出116、226、208bp目的基因片段,經(jīng)標(biāo)記后作為檢測PE、EV71、CoxA16的3種高純度的基因探針,對相應(yīng)病毒RNA的最低檢出限均為1pg,可分別與PE(+)、EV71(+)、CoxA16(+)標(biāo)本提取的RNA發(fā)生特異性雜交,與乙型腦炎病毒、諾如病毒、輪狀病毒、H3N2、甲型H1N1流感病毒的核酸無雜交反應(yīng)。結(jié)論制備的PE、EV71及CoxA16基因探針靈敏、特異,操作簡單,適用于手足口病病原的實(shí)驗(yàn)室檢測。
[Abstract]:Objective to prepare digoxigenin-labeled gene probe and to detect enterovirus (Pan-enterovirus,PE), enterovirus 71 (Enterovirs 71EV71) and coxsackie virus A group 16 (Coxsachie virus,CoxA16) in fecal specimens of patients with hand, foot and mouth disease by molecular hybridization. Methods according to the published gene sequence of GenBank, three pairs of specific oligonucleotide primers were designed in the conserved region of PE,EV71,CoxA16 and detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The virus was isolated from PE,EV71,CoxA16 positive samples, and the target gene of RNA, was extracted with RT-PCR amplification products as gene probe. Random primer method was used for Digxigenin-11-dUTP labeling. The sensitivity and specificity of three gene probes were detected by molecular hybridization test. Results the 116226208bp target gene fragments were amplified by RTPCR and labeled as three high purity gene probes for detection of PE,EV71,CoxA16. The minimum detection limit for the corresponding virus RNA was 1 PG, which could be compared with PE (), EV71 (),. The RNA extracted from CoxA16 () samples showed specific hybridization, and no hybridization reaction was found with Japanese encephalitis virus, norovirus, rotavirus, H _ 3N _ 2 and A H1N1 influenza virus. Conclusion the PE,EV71 and CoxA16 gene probes prepared are sensitive, specific and easy to operate, and can be used for the laboratory detection of the pathogens of hand, foot and mouth disease.
【作者單位】： 泰安市疾病預(yù)防控制中心;
【基金】：泰安市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.201340629)
【分類號】：R440;R725.1

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本文編號：2339948