【摘要】：研究目的：研究炎性Treg細(xì)胞(IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞)在膽道閉鎖(Biliary Atresia, BA)肝內(nèi)膽管組織中的表達情況,觀察Foxp3基因啟動子區(qū)的DNA甲基化對IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞分化的影響。初步闡明Foxp3基因甲基化對Treg細(xì)胞亞群分化及其在BA發(fā)病中的作用。研究方法：確診為膽道閉鎖患兒32例,在行Kasai手術(shù)中取肝臟組織,對照組30例,部分肝臟組織行勻漿取上清進行ELISA檢測IL-6.IL-17、IL-1β、IL-12p40、TGF-β、 IL-23、IL-10等細(xì)胞因子含量：RT-qPCR、Western Blot檢測Foxp3和ROR-yt基因的表達情況；部分組織行免疫熒光化學(xué)染色觀察IL-17+Foxp31Treg細(xì)胞分布；部分肝臟組織行流式細(xì)胞術(shù)檢測,觀察IL-17-Foxp3+Treg細(xì)胞、IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞及IL-17+ Th17細(xì)胞的比例,并通過流式分選這三種細(xì)胞,分別通過亞硫酸氫鈉處理后測序法(BSP)檢測IL-17+Th17細(xì)胞、IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞中Foxp3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)：同時,留取部分IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞進行增殖培養(yǎng),檢測細(xì)胞上清液中相關(guān)細(xì)胞因子含量。通過輪狀病毒(Rotavirus,RRV)建立膽道閉鎖動物模型,新生的BALB/c小鼠隨機分為3組：①RRV組：新生鼠在出生后12小時內(nèi)腹腔注射RRV：②對照組：新生鼠在出生后12小時內(nèi)腹腔注射培養(yǎng)基；③甲基化干預(yù)組(Aza組)：新生鼠在出生后12小時內(nèi)腹腔注射RRV,并在出生后每天腹腔注射甲基化抑制劑Aza.分別取注射病毒后第4天、第7天、第11天的小鼠肝臟組織,ELISA檢測IL-6、IL-17、IL-1β、IL-12p40、TGF-β、IL-23等細(xì)胞因子含量；RT-qPCR、Western Blot檢測Foxp3和ROR-yt基因的表達情況;免疫熒光化學(xué)染色觀察IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞分布；流式細(xì)胞術(shù)檢測,觀察IL-17-Foxp3+Treg細(xì)胞、IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞及IL-17Th17細(xì)胞的比例,并通過流式分選這三種細(xì)胞,BSP法檢測IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞、IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞中Foxp3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。為了探究局部炎性環(huán)境對IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞分化的影響,提取小鼠肝臟CD4+ naive T細(xì)胞,分別在以下三種細(xì)胞培養(yǎng)體系中進行培養(yǎng)：①TGF-β, anti-IFN-γ, anti-IL-4;②TGF-β, anti-IFN-γ, anti-IL-4, Aza; ③TGF-β, IL-6, anti-IFN-γ, anti-IL-4。在不同培養(yǎng)環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)7天,ELISA檢測各培養(yǎng)體系中IL-10、IL-17等細(xì)胞因子的含量,同時收集細(xì)胞,檢測細(xì)胞中IL-17-Foxp3+Treg細(xì)胞、IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞及IL-17+Thl7細(xì)胞的比例變化,檢測三種體系中Foxp3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。實驗結(jié)果：在BA患兒和動物模型肝臟組織中,與對照組比較,BA組肝臟組織匯管區(qū)周圍IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞逐漸升高,第7天達到高峰。此時,BA組小鼠的黃疸率(85.3±12.36%)和陶土色大便發(fā)生率(80.6±15.22%)達到最高,BA小鼠開始逐漸死亡,14天的生存率僅為20.5±3.24%。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)BA組IL-12p40(Thl相關(guān)因子)、IL-23、IL-17(Th17相關(guān)因子)、IL-10、TGF-β1(Treg細(xì)胞相關(guān)因子)IL-6、IL-1β較對照組均顯著升高,且促炎細(xì)胞因子(IL-12p40、IL-23、 IL-17、IL-6、IL-1β)較抑炎細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β)含量更高。通過將患兒肝臟中IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞進行體外增殖培養(yǎng),我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比,細(xì)胞上清中IL-17細(xì)胞因子含量顯著性增高(32.45±12.375pg/ml vs 3.84±1.352pg/ml),說明在BA肝臟中,IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞具有顯著的促炎作用。甲基化檢測顯示與對照組比較,BA組肝臟組織中Foxp3啟動子CpG島甲基化顯著上升(人：73.2±16.17% vs. 2.9±0.85%;小鼠：70.3±10.51% vs.13.5±4.67%,p0.01)。通過動物干預(yù)實驗,我們發(fā)現(xiàn)甲基化干預(yù)后的小鼠與RRV組相比,黃疸率(60.3±12.34%)和陶土色大便發(fā)生率(57.5±11.25%)較BA組均有顯著下降,而且,出現(xiàn)死亡小鼠的時間(8.3±0.58天)延后、感染后14天的總體生存率(59.3±9.52%)有明顯上升。肝臟組織匯管區(qū)周圍IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞浸潤減少,細(xì)胞比例下降,同時也伴隨著炎癥細(xì)胞因子含量的明顯下降。Foxp3基因甲基化水平(25.3±9.63%)下降,Foxp3表達增強,基因和蛋白水平也相應(yīng)地明顯上升。體外細(xì)胞誘導(dǎo)實驗中,經(jīng)過7天的培養(yǎng),在培養(yǎng)環(huán)境①中,Foxp3基因表達明顯增強,IL-17-Foxp3+Treg細(xì)胞比例最高,達到76.4±14.2%, IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞比例為3.7±0.49%, Foxp3基因甲基化率約為9.4±3.7%；在Aza干預(yù)下,培養(yǎng)基中IL-10、TGFβ1濃度有明顯升高,IL-17-Foxp3+Treg比例上升,達到85.6±18.49%, Foxp3甲基化率下降至6.2±2.45%；在培養(yǎng)環(huán)境③中,Foxp3基因表達明顯減弱,IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞比例為11.6±3.79%,而IL-17- Foxp3+Treg細(xì)胞比例最低,約為1.45±0.28%, IL-17+Th17細(xì)胞比例最高,約為58.2±10.2%,。實驗結(jié)論：1.在膽道閉鎖患兒肝臟組織匯管區(qū)周圍,IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞比例較對照組明顯增高；在動物實驗肝臟組織中,IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞比例逐漸升高,在第7天達到峰值,之后比例逐漸下降。表明IL-17+Foxp3+Trreg細(xì)胞在BA肝臟中存在并參與了膽管免疫炎性反應(yīng)。2.體外培養(yǎng)IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞,上清中能夠檢測到明顯IL-17細(xì)胞因子,說明IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞具有促炎作用。3.BA肝臟組織中IL-17+Foxp3+Treg的增殖分化受到Foxp3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化的調(diào)節(jié),當(dāng)Foxp3甲基化升高時,基因表達減低,細(xì)胞向IL-17+Foxp3+ Treg細(xì)胞分化加強；當(dāng)Foxp3甲基化下降時,基因表達升高,細(xì)胞向IL-17-Foxp3+ Treg細(xì)胞分化增加。4. IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞參與了膽道閉鎖膽管炎癥。抑制Foxp3基因甲基化可以減少肝臟匯管naive細(xì)胞向IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞分化,減輕BA小鼠肝臟內(nèi)的炎癥反應(yīng),降低小鼠的黃疸率,延長生存率,可能成為將來膽道閉鎖免疫治療的新方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R726.5

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本文編號：2332927