【摘要】：目的腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移是影響結(jié)腸癌治療的重要原因,有研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,抑制T-cadherin表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力。本研究探討siRNA敲減DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyl transferase 1,DNMT1)基因表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞T-cadherin基因甲基化及細(xì)胞生物學(xué)行為影響。方法設(shè)計(jì)針對DNMT1的siRNA1、siRNA2和siRNA3重組質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染HT-29、SW620和HCT116細(xì)胞系,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測DNMT1表達(dá),以篩選敲減效率最高的DNMT1siRNA和細(xì)胞系。用敲減效率最高的DNMT1siRNA轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞系,采用甲基化特異性PCR檢測T-cadherin甲基化水平,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白印跡法檢測T-cadherin表達(dá)。用敲減效率最高的DNMT1siRNA轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞系,采用噻唑藍(lán)比色法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移情況,觀察敲減DNMT1對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;同時(shí)設(shè)置T-cadherin shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,觀察同時(shí)敲減DNMT1和T-cadherin對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果 DNMT1siRNA1重組質(zhì)粒對HT-29細(xì)胞系DNMT1的敲減效果最好。DNMT1siRNA1轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞后,DNMT1組T-cadherin基因甲基化水平明顯低于空質(zhì)粒組和空白組,DNMT1組與空質(zhì)粒組(F=314.182)和空白組(F=283.625)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均P0.001。DNMT1組和聯(lián)合組DNMT1mRNA表達(dá)量(0.27±0.08)和蛋白表達(dá)量(0.41±0.12)顯著低于空質(zhì)粒組和空白組。其中mRNA表達(dá),DNMT1組與空質(zhì)粒組(F=544.581)和空白組(F=525.811)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均P0.001;聯(lián)合組與空質(zhì)粒組(F=507.501)和空白組(F=494.958)也差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均P0.001。蛋白表達(dá)量,DNMT1組與空質(zhì)粒組(F=217.550)和空白組(F=275.469)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均P0.001:聯(lián)合組與空質(zhì)粒組(F=321.707)和空白組(F=407.225)也差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均P0.001:而DNMT1組和聯(lián)合組比較mRNA(F=0.002,P=0.965)和蛋白表達(dá)量(F=0.811,P=0.394)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DNMT1組T-cadherin mRNA表達(dá)量(1.17±0.34)和蛋白表達(dá)量(1.38±0.54)顯著高于聯(lián)合組、空質(zhì)粒組和空白組。其中mRNA表達(dá),DNMT1組與聯(lián)合組(F=433.103)、空質(zhì)粒組(F=313.768)、空白組(F=372.118)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均P0.001。對于蛋白表達(dá)量,DNMT1組與聯(lián)合組(F=89.315)、空質(zhì)粒組(F=156.745)、空白組(F=196.702)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均P0.001。而聯(lián)合組與空質(zhì)粒組(F=1.310,P=0.262;F=0.144,P=0.714)和空白組(F=3.713,P=0.064;F=0.038,P=0.850)的mRNA和蛋白表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與聯(lián)合組、空質(zhì)粒組和空白組比較,DNMT1組第24、36、48、72h的A值顯著減小,F組別=14.479,P0.001;F時(shí)間=37.755,P0.001。DNMT1組與聯(lián)合組(F=1 004.194,P0.001)、空質(zhì)粒組(F=1 190.815,P0.001)、空白組(F=781.018,P0.001)比較細(xì)胞總凋亡率顯著升高;DNMT1組穿膜細(xì)胞數(shù)目為(61.3±10.7)個(gè),與聯(lián)合組(F=86.730,P0.001)、空質(zhì)粒組(F=282.962,P0.001)、空白組(F=152.538,P0.001)比較顯著減少。DNMT1組細(xì)胞遷移距離為(235.8±6.3)μm,與聯(lián)合組(F=2 535.55,P0.001)、空質(zhì)粒組(F=9 767.233,P0.001)、空白組(F=8 420.830,P0.001)比較顯著減少。而聯(lián)合組與空質(zhì)粒組和空白組比較,A值、細(xì)胞總凋亡率、穿膜細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞遷移距離均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。結(jié)論 DNMT1siRNA1可有效敲減HT-29細(xì)胞DNMT1表達(dá),逆轉(zhuǎn)T-cadherin高甲基化狀態(tài)并上調(diào)其表達(dá)。敲減DNMT1可明顯抑制HT-29細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡,降低其侵襲和遷移能力;而同時(shí)敲減T-cadherin能夠逆轉(zhuǎn)此種現(xiàn)象,說明敲減DNMT1引起的細(xì)胞生物學(xué)行為改變可能是通過T-cadherin來實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【作者單位】： 重慶市第九人民醫(yī)院普外科;重慶市第九人民醫(yī)院急診科;
【基金】：重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(2012-2-291)
【分類號】：R735.35

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本文編號：2332723