發(fā)布時間：2018-11-14 15:56

【摘要】：合浦珠母貝(Pinctada fucata)是最主要的海水產(chǎn)珠貝,具有一系列優(yōu)秀的經(jīng)濟性狀。但近年來面臨種質(zhì)退化、育珠質(zhì)量差等問題,嚴重制約珍珠貝產(chǎn)業(yè)發(fā)展。通過選育優(yōu)良品種來提振產(chǎn)業(yè)發(fā)展顯得尤為緊迫。利用分子標記輔助育種技術(shù)加強重要經(jīng)濟性狀尤其是生長和育珠性狀的選育是一條可行途徑。為此需要著重加強合浦珠母貝基礎(chǔ)生理的研究,包括發(fā)育調(diào)控、貝殼形成等。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)是一類多功能細胞因子,包含眾多成員。其中大多數(shù)都具有成骨活性,另外這類蛋白在胚胎發(fā)育、組織發(fā)生、生殖調(diào)控等方面也有重要作用,但在軟體動物中相關(guān)研究還很少。本研究以本課題組的合浦珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),克隆了兩個BMP家族基因BMP3和BMP10,并初步嘗試探究其功能。具體結(jié)果如下:1.合浦珠母貝BMP3基因的克隆與功能初步研究。該研究以從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的注釋為BMP3同源基因的片段為基礎(chǔ),通過RACE技術(shù)獲得合浦珠母貝BMP3基因完整c DNA序列。該基因c DNA全長2710 bp,包含開放閱讀框(ORF)1470 bp,5'非翻譯區(qū)(UTR)350 bp,3'UTR 890 bp,3'端有典型的加尾信號(AATAAA)。將該基因命名為Pf BMP3(Gene Bank登錄號:KT956999)。Pf BMP3基因編碼489個氨基酸,預測其分子量為56.64 k Da,理論等電點(PI)為9.80�？缒そY(jié)構(gòu)預測表明Pf BMP3編碼蛋白位于胞外且無跨膜結(jié)構(gòu)。信號肽預測Pf BMP3編碼蛋白帶有一個N端信號肽(1-21 aa)。功能結(jié)構(gòu)域預測顯示Pf BMP3編碼蛋白含有一個前結(jié)構(gòu)域(22-361 aa)和成熟蛋白區(qū)(362-489 aa),存在特殊的成熟區(qū)剪切位點結(jié)構(gòu)Arg-X-X-Arg。成熟蛋白區(qū)包含128個氨基酸殘基,預測其分子量為14.59 k Da,理論等電點為8.90。成熟蛋白區(qū)包含一個轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor beta,TGF-β)結(jié)構(gòu)域(387-489 aa),TGF-β結(jié)構(gòu)域包含7個半胱氨酸殘基。針對合浦珠母貝擔輪幼蟲期、D-型期、殼頂期、眼點期、變態(tài)期共5個發(fā)育時期的實時熒光定量PCR分析顯示,Pf BMP3高表達于擔輪期和變態(tài)期,提示Pf BMP3參與幼體擔輪期、變態(tài)期的發(fā)育調(diào)控。針對外套膜、鰓、腸、閉殼肌、珍珠囊、肝胰腺、性腺、血細胞共8種組織的實時熒光定量PCR分析顯示Pf BMP3在鰓和外套膜高表達。針對外套膜組織的原位雜交分析顯示,Pf BMP3高表達于外套膜內(nèi)褶的內(nèi)表皮和中褶的外表皮,另外在外套膜外側(cè)上皮細胞也有表達。推測Pf BMP3參與貝殼的形成。貝殼缺刻實驗顯示缺刻處理24小時后Pf BMP3在外套膜中的表達量顯著上升,缺刻處理36小時后Pf BMP3在鰓中的表達量顯著上升。表明Pf BMP3可能與貝殼的損傷修復相關(guān)。將合浦珠母貝在不同鈣離子濃度水體下養(yǎng)殖三個月后,分析鰓和外套膜組織的Pf BMP3基因表達量,表明Pf BMP3在低鈣離子濃度組(添加EDTA組)的表達量顯著高于海水組和高鈣離子組(添加氯化鈣組)。和已被證明參與鈣離子代謝的鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,Ca M)基因有相似的變化趨勢。表明Pf BMP3可能參與貝殼形成過程中的鈣離子代謝調(diào)控。對Pf BMP3基因進行RNA干擾后,檢測Pf BMP3和Pf Ca M的表達量變化,顯示Pf Ca M的表達量出現(xiàn)下降。因此推測Pf BMP3基因在貝殼形成過程中可能通過與Pf Ca M的某種關(guān)聯(lián)作用來調(diào)控鈣離子代謝。2.合浦珠母貝BMP10基因的克隆與功能初步研究。以從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的注釋為BMP10同源基因的兩個片段為基礎(chǔ),擴增補全中間序列,在此基礎(chǔ)上通過RACE技術(shù)獲得合浦珠母貝BMP10基因c DNA序列。該基因c DNA長1752 bp,包含開放閱讀框(ORF)1344 bp,5'UTR 293 bp,3'UTR 115 bp。將該基因命名為Pf BMP10(Gene Bank登錄號:KU529148)。Pf BMP10基因編碼447個氨基酸,預測其分子量為51.92 k Da,理論等電點(PI)為6.14�？缒そY(jié)構(gòu)預測顯示Pf BMP10編碼蛋白蛋白位于胞外且無跨膜結(jié)構(gòu)。信號肽預測Pf BMP10含有一個N端信號肽(1-23 aa)。功能結(jié)構(gòu)域預測顯示Pf BMP10編碼蛋白含有一個前結(jié)構(gòu)域(24-337 aa)和成熟蛋白區(qū)(338-447 aa)。帶有成熟區(qū)剪切位點結(jié)構(gòu)Arg-X-X-Arg。成熟蛋白區(qū)包含一個TGF-β結(jié)構(gòu)域(344-447 aa),TGF-β結(jié)構(gòu)域含有7個半胱氨酸殘基。針對合浦珠母貝擔輪幼蟲期、D-型期、殼頂期、眼點期、變態(tài)期共5個發(fā)育時期的熒光定量PCR實驗顯示,Pf BMP10高表達于擔輪幼蟲期和變態(tài)期,預示Pf BMP10可能參與合浦珠母貝幼體擔輪幼蟲期、變態(tài)期發(fā)育調(diào)控。針對成體貝外套膜、鰓、腸、閉殼肌、珍珠囊、肝胰腺、性腺、血細胞共8種組織的實時熒光定量PCR分析顯示Pf BMP10在鰓和外套膜高表達。推測Pf BMP10參與貝殼的形成。貝殼缺刻實驗顯示缺刻處理24小時后Pf BMP10在鰓和外套膜中的表達量均顯著上升,表明Pf BMP10可能與貝殼的損傷修復相關(guān)。該研究可為BMP家族基因功能及貝殼形成機理研究提供參考。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2331623